博 士 （地 球環 境科学）佐藤敦子
学位論文題名 ●
Molecular genetic studies on the noncanonlCal 4 勿Z ／Z4 ．4geneSOfArabidopSiSbymeanSOf
OVereXpreSS10nStrategy
（過剰発現法を用いたシロイヌナズナ非典型的4z 絖／Z44 遺伝子の 分子遺伝学的研究）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
Aux／M4遺 伝 子 族 は オ ー キ シ ン を 投 与 す る こ と に よ っ て 発 現 が 素 早 く 上 昇 す る 遺 伝 孑 群 で 、 オ ー キ シ ン の 一 次 反 応 を 担 っ て い る の で は な ぃ か と 古 く か ら 考 え ら れ て き た 。 本 年 、 オ ー キ シ ン 受 容 体 丁IR1に オ ー キ シ ン と 共 に 結 合 す る こ と が 分 か り （Tanetal． ，2007） 、 オ ー キ シ ン 信 号 伝 達 系 で 受 容 体 直 下 で 働 く 因 子で ある こ とが 確 定し た 。AuX/L亀Aタ ン パ ク 質 に は 保 存 さ れ てい る4つの ド メイ ン 、ド メ インIか らWがあ る 。ド フ ソンHま 転 写調 節因 子 の抑 制 ドメ イ ンで ある 。 ド メ イ リIIとNは オ ー キ シ ン 応 答 因 子 （ARF） も 共 通 し て 持 っ て い て 、 こ の ド フ ソ ン を 通 じ てAu〆IAAはARFに 結合 する こ と が で き る の で 、 通 常 、A耐nAはARFに 結 合 し てARFの 転 写 調 節 能 を 抑 制 し て い る 。 オ ー キ シ ン 受 容 体 丁IR1は ユ ビ キ チ ン リ ガ ー ゼSCF複 合 体 のFボ ッ ク ス ・ タ ン パ ク 質 で 、 基 質 結 合 部 位 を 提 供 し て い る 。TIR1の 基 質 結 合 部 位 は オ ー キ シ ン （1― イ ン ド ー ノ レ 酢 酸 ） に も 結 合 す る こ と が で き 、 オ ー キシ ン に結 合 する とAux/nAタ ン パク 質 のド メ インHに 対す る 親 和 性 が 増 加 す る 。 そ の 結 果 、 高 濃 度 の オ ー キ シ ン 存 在 下 で はAuX/nAタ ン パ ク 質 は プ ロ テ ア ソ ー ム で 積 極 的 に 分 解 さ れ 、Alx/IAAレ ベ ル が 低 下 す る の で 、ARFの 転 写 調 節 能 が 回 復 し て 、 さ ま ざ ま な 下 流 の 遺 伝 子 発 現 調 節 が 起 こ り 、 オ ー キ シ ン 応 答 が 起 こ る と 考 え ら れ て い る 。 一 方 、AuX/IAA自 身 も オ ー キ シ ン 誘 導 陸 な の で 、 し ば ら く す る とAuX/LへA レ ベ ル が 元 に 戻 り 、 オ ー キ シ ン 応 答 は 停 止 す る 。 こ の フ イ ー ド バ ッ ク 調 節 が オ ー キ シ ン の 一 過 的 応 答 現 象 の 分 子 的 原 因 と 考 え ら れ る 。 月 蝋 彪 弘 遺 伝 子 が 原 因 と な る 優 陸 突 然 変 異 体 が 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の29個 の 月zとz／ 翻4の 内 、9個 に つ い て 報 告 さ れ て い る が 、 そ の す べ て が ド メ インHの ア ミノ 酸置 換 によ っ て起 こ って い る。 ドメ イ ンInこ アミ ノ 酸置 換が 起 こ る と 、TIR1に 結 合 で き な く な りAuX/L岨 が分 解 され な くな って 蓄 積さ れ るこ と によ り 生じ る優 陸 突然 変 異だ と 考え られ る 。 典 型 的 恤/L岨 タ ン く ク 質 に は ド メ イ り か らNが 存 笛 尹 る が 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の29個 のA1】x／IAAの 中 に は ド メ イ ンII だ け が な い 非 典 型 的Au〆IAAが4個 存 在 す る 。 ま た も う ー つ のAuX/IAAは 、 ド メ イ ンInこ 優 陸 突 然 変 異 に 似 た ア ミ ノ 酸 配 列 を 持 っ て い る （IAA31） 。 本 研 究 で は 、 こ の 中 でIん セOに 構 造 が 似 て い る3個 の タン パ ク質LへA20とIAA30とL岨31（I
」 ん蛇0サ ブ ファ ミ リー ）に 着 目し た 。Lん蛇Oと30はド メイ ンHを 持っ て いな い のに 対し 、IAA31は 優 陸突 然 変異 型ド メ インII を 持 っ て い る の で 、 そ の 機 能 を 互 い に 比 較 す る の に 適 し て い る か ら で あ る 。 こ れ ら 非 典 型 的AuX／IAAの 生 理 的 饑 能 を 推 測 す る た め に 、 こ れ ら 遺 伝 子 を カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ ィ ル ス 甑Sプ ロ モ ー タ ー を利 用し て 過剰 発 現さ せ 、ど のよ う な 表 現 型 異 常 が 生 ず る か 観 察 し た 。 ま た 対 照 と し て 、 典 型 的4fziシ 翻4で あ る 閉4J9り 必Eと の 過 乗 暁 現 体 も 作 成 し て そ の 表 現型 を 比較 し た。
凪 他 伽 過 剰 発 現 体 （ 閉 彪 りOX） は 半 矮 性 で 、 芽 生 え の 胚 軸 も 短 く 、 そ の 成 長 方 向 は 胚 軸 も 根 も 完 全 に 乱 れ て い
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て 、 屈 地 性 が と も に 異 常 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 花 茎 は し だ れ て い て 、 屈 地 性異 常 を嗣 芟1，た ほ か、 稔 性も 低 下し て い た 。 種 子 の 発 芽 率 も 低 下 し て い た 。 主 根 の 成 長 は 発 芽 後 す ぐ に 停 止 し て し ま う が 、 そ れ は 根 端 分 裂 組 織(RAM)が 分 靈2能 を 失 っ て'イ ヒ して し まう こと(RAMの 崩 壊） に よる 。 しか し同 時 に、 主 根カ ゝ ら側 根が 生 じ、 側 根が 阻 害さ れ なが ら も 成 長 す る の で 、 植 物 は 半 矮 陸 な が ら 生 育 す る 。 子 葉 の 葉 脈 形 成 も 異 常 で 、 最 も 異 常 な 場 合 、 中 央 葉 脈 す ら 完 全 に で き な か っ た 。
IAA30 0Xは 野 生 型 と ほ ぼ 同 じ 大 き さ だ っ た 。 芽 生 え 胚 軸 の 成 長 方 向 は や や 異 常 で 、 根 の 成 長 方 向 はIAA20 0X 同 様 完 全 に 異 常 だ っ た 。L4A30 0XもIAA20 0X同 様 、 ． 根 の 成 長 異 常 が 起 こ る が 、 そ の 程 度 はIAA20 0Xよ り や や 軽 い 。 子 葉 の 葉 脈 形 成 は 比 較 的 正 常 で 、 こ の3種 のOXの 中 で 一 番 異 常 が 軽 う ゝ っ た 。
IAA31 0XはIAA20 0Xほ ど で は な い が 野 生 型 よ り 小 さ く 、 最 も 異 常 な ＃2系 統 で は 主 茎 の 成 長 が 早 期 に 停 止 し て し ま う 異 常 が 起 こ っ た 。 芽 生 え 胚 軸 の 長 さ は 野 生 型 と 同 じ で 、B丕 軸 の 成 長 方 向 は や や 異 常 だ っ た が 、 根 の 成 長 方 向 は 相 当 程 度 異 常 だ っ た 。IAA31 0Xも 根 の 成 長 阻 害 が 起 こ る が 、 そ の 程 度 は か な り 軽 く 、 主 根 のRAMの 崩 壊 が 起 こ ら な い 個 体 も あ っ た 。 子 葉 の 葉 脈 形 成 は か な り 異 常 で 、 中 央 葉 脈 が や っ と 形 成 さ れ る 程 度 に 止 ま っ た 。 こ れ ら 遺 伝 子 の 発 現 をRT一PCRで 調 べ た と こ ろ 、L4A26cD発蔘 劼ミ ロ ゼッ ト 葉と 茎 で低 うゝ っ た他 は 、い ず れの 遺 伝子 も だ い た い ど の 組 織 で も 発 現 し て い た が 、IAA31は 特 に 果 実 で 発 現 が 高 か っ た 。L4A20Lエlatオ ー キ シ ン 投 与 後30分 後 に は 発 現 増 加 が 観 察 さ れ オ ー キ シ ン 誘 導 陸 で あ っ た が 、IAA3A1オ ー キ シ ン 誘 導 陸 で は な か っ た 。 以 上 を ま と め る と 、 こ れ ら3個 の 遺 伝 子 のOXは お お よ そ 類 似 し た 表 現 型 異 常 を 示 し た が 、L4A20 0Xの 異 常 が 最 も 強 く 、 そ の 次 がIAA． ヨ 卵 、IAA．?10Xの 異 常が 最 も軽 か った 。野 生 型のArn:／ 勿 4遺伝 子は 、 その 産 物が プ ロテ ア ソー ム に よ っ て 積 極 的 に 分 解 さ れ る た め 、355プ ロ モ ー タ ー で 過 剰 発 現 さ せ て も 表 現 型 異 常 は ほ と ん ど 生 じ な い と 考 え ら れ て い る 。 そ こ で 、JAA19 0Xの 表 現 型 を 調 べ た と こ ろ 、 や や 植 物 体 が 小 さ く な る 系 統 が 生 じ た こ と と 側 根 形 成 能 が 低 下 し た 他 は 、 表 現 型 異 常 は 見 ら れ ず 、 従 来 の 見 解 を 支 持 す る 結 果 と な っ た 。 以 上 の 結 果 は 、IAA20サ ブ フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 は ド 冫 リ ンIを 失 っ て い た り 、 そ の ア ミ ノ 酸 配 列 が 独 特 な こ と か ら 、 過 剰 発 現 させ ると 表 現型 異 常が 出 現し や すぃ こ と を 示 唆 し て い る 。
IAA20rj‑ブ フ ァ ミ リ ー 遺 伝 子 のOXで は 主 根 のRAMが 崩 壊 す る と い う 表 現 型 が 見 ら れ た が 、 こ れ はpltl pIt2‑重 突 然 変 異 体 の 表 現 型 と よ く 似 て い る 。PL 71j.ARF5/Mf） とARF7/NPH4a)下 流 で 働 く 遺 伝 子 で 、RAMの 確 立 と 糸 隹 持 に 働 い て い る(Aida etal． ，2004)。355プ ロ モ ー タ ー はRAMで 潛 陸 が あ る こ と と 、IAA2(1 3a1PL7やARF5や 4鯛 様 、 根 端 の 静 止 中 心 と 根 冠 の コ ル メ ラ に 特 異 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 で あ る こ と と を 考 え る と(Nawy et甜 ． ，2005)、IAA20と30は 根 端 分 裂 組 織 の 確 立 と 維 持 に ARF5と 7の 活 陸 を 調 節 す る こ と に よ っ て 機 能 し て い る と 考 え ら れ る 。 ド メ イ ンIIを 持 た な いIAA20と30は オ ー キ シ ン 依 存 的 な 分 解 を 受 け な い と 考 え ら れ る の で 、 他 の 典 型 的Aux/IAAよ ル レ ベ ル の 変 動 が 少 な ぃ と 想 像 で き る が 、 ー 方 で こ れ ら タ ン パ ク 質 は オ ー キ シ ン の 一 次 反 応 を 担 う こ と は で き な ぃ 。 本 研 究 の 成 果 は 、 典 型 的Aux/IAAと 非 典 型Aux/IAAが ど の よ う に 協 調 し てRAMの 発 生 と 糸 隹 持 に 関 わ っ て い る の か を 詳 細 に 明 ら か に す る 道 を 開 い た と 言 え よ う 。
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学 位論文審査の要旨
主査 准教授 山崎健一 副査 教授 森川正章 副査 教授 大原 雅
副査 教授 山本興太朗（大学院理学研究院）
学位論文題名
Molecular genetic studies on the noncanonical Aux ／ ． Z44geneSOfArabidopSiSbymeanSOf OVereXpreSS10nStrategy
（過剰発現法を用いたシロイヌナズナ非典型的Aux ／翻4 遺伝子の 分子遺伝学的研究）
Aux 翻 4 遺伝子族 はオーキ シンの一 次反応を 担ってい る遺伝子で，シ口イヌナズナには 2 9 個存在する。典型的 Aux 肛 AA 夕ンパク質にはドメインI からrv カ溶在するが，オーキシン 受容体結合 部位であ るドメイ ン H を欠い ている非 典型的 Au 姐 AA も存在する。また， MA31 のように，ドメインII に優性突然変異に似たアミノ酸配列を持っているAl 亅x 肛AA も存在する。
本研究では，シ口イヌナズナAl 亅x 肛AA の中でドメインH を持たないI ん地O と強AL30 ，そして 前述の瓰 A31 に着目し，これら互いにアミノ酸配列がよく似ている四4 勿サブファミリー遺 伝子をカリフラワーモザイクウィルス謝 i5 プ口モーターを用しゝて過剰発現させた形質転換体 を作成した。そして，この過剰発現体でどのような表現型異常が生ずるか観察することによ って，非典型的 HIz 彪 44 の生理的機能を推測することを試みた。また対照として，典型的 4zz 彪 4 岔 で あ る 以 4E 班 2 鰡 2 の 過 剰 発 現 体 も 作 成 し て そ の 表 現 型 を 比 較 し た 。 四 A2 の過剰発現体（以イ 2 口 0X ）は半矮性で，芽生えの胚軸も短く，その成長方向は胚 軸も根も完全に乱れていて，屈地性がともに異常であることが示唆された。花茎はしだれて いて，屈地性異常を示唆したほか，稔性も低下していた。種子の発芽率も低下していた。主 根の成長は発芽後すぐに停止してしまうが，それは根端分裂組織が分裂能を失って分化して しまうこと（根端分裂組織の崩壊）による。しかし同時に，主根から側根が生じ，側根が阻 害されながらも成長するので，植物は半矮I 生ながら生育する。子葉の葉脈形成も異常で，最 も異常な場合，中央葉脈すら完全にできなかった。
皿 43DOX と 仇 4 卯 OX も 以 イ 勿 0X と 類 似 し た 表 現 型 異 常 を 示 し た が ，朋 A 勿 0X ほど 異常は強くなかった。野生型の4zz 船翻4 遺伝子は，その産物がプ口テアソームによって積極 的に分解されるため，錨 i5 プ口モ一夕ーで過剰発現させても表現型異常はほとんど生じない と考えられている。実際皿 4J ウ 0X では，やや植物体が小さくなり側根形成能が低下した系
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