博士（医学）廣川淳一 学位論文題名
Identification of Macrophage :N/Iigration Inhibitory Factor in Adipose Tissue and Its Induction by Tumor Necrosis Factor‑ a
（脂肪組織におけるマクロファ―ジ遊走阻止因子の同定と 腫瘍壊死因子aによるその誘導）
学 位 論 文 内 容 の 要旨
肥満は脂肪細胞の数と大きさの増加により脂肪組織カ弸巴大した状態であり、インスリ ン非依存性糖尿病(NIDDM)、高血圧、虚血性心疾患などとの関連が臨床上注目されて いる。脂肪組織は単にエネルギーを脂肪として蓄積するだけの臓器ではなく、様々な生 理活性物質を分泌する組織であることが最近の研究により明らかとなりつつある。この 中にtま腫瘍壊死因子 （tumor necrosis factor‑d、以下TNFd）や摂食・エネルギー消 費を調節する肥満遺伝子産物レプチン、また凝固線溶系の調節に関与するプラスミノー ゲンアクチベーターインヒビター1などがある。これらの物質のうちでも特にTNF は、
肥満時の脂肪細胞で過剰発現しており、肥満やNIDDMに伴うインスリン抵抗性の発現に おいて重要な役割を果たしていると考えられている。しかしその機序に関しては未だ十 分解明されたとは言えない。
マクロファージ遊走阻止因子(macrophage migration inhibitory factor、以下MIF)は 当初マクロファージの遊走を阻止する活性化Tリンバ球由来のサイトカインとして同定 され、マクロファージを炎症部位に集める免疫機能を持っと考えられてきた。しかしそ の後の研究により、MIFはTリンノヾ球以外にもマクロファージ自身や下垂体前葉細胞、
レンズなど多様な細胞から産生分泌されることが明らかとなり、その生理作用は免疫応 答のみにとどまらない可能性が示唆されている。上述の如く肥満時には脂肪細胞での TNF口産生は亢進しているが、TNFaはマクロファージからのMIF分泌を促進すると報 告されている。そこで我々は、MIFとインスリン抵抗性あるいは糖脂質代謝との関連に つ いて の 研究の第一 歩として、 脂肪細胞に おけるMIFの発現につ いて検討し た。
脂肪細胞のサンプルとしては、6週齢の雄性S‑Dラットから摘出した副睾丸周囲脂肪 組織およびin vitroの脂肪細胞培養系として確立しているマウス3T3‑L1細胞を用いた。
3T3‑L1細胞はデキサメサゾン、インスリン、イソブチルメチルキサンチンを含む分化 誘導メデイウムで3日間分化誘導を行い、その後さらにインスリンのみを含む成熟メデイ
ウム で3日ご とにメ デイ ウム 交換 を行 い、 分化 誘導 開始9日目 の良 く分 化した脂肪細胞 を実験に使用した。
ラ ットMIF cDNAをプ ロー ブと して 用い たノー ザン ブロ ッテ イン グに より、ラット脂 肪組 織に おい てMIF mRNAが 発現 して いる ことが 示さ れた 。脂 肪組 織内 には脂肪細胞以 外に も血 管及 び問質を構成する細胞が含まれている。これらの細胞を除くため脂肪組織 をコ ラゲ ナー ゼ消 化し た後 、比 重に より 分離し た成 熟脂 肪細 胞画 分に もMIF mRNAの発 現 は 同 様 に 認 め ら れ た。 さ ら に3T3‑L1脂 肪 細 胞に おい てもMIF mRNAの発 現が 認め ら れた。
脂 肪細 胞内 にMIF蛋白 質が 存在 する こと を確 かめ るた めに 、抗 ラッ トMIF抗体を用い てウェスタンブロッテイングと免疫組織染色を行った。ウェスタンブロッテイングでは、
ラット脂肪組織およびマウス3T3‑L1脂肪細胞の両者でMIF蛋白質が12.5 kDaの単一なノヾ ンド とし て同 定さ れた 。ラ ット 脂肪 組織 の免疫組織染色においても、MIF蛋白質は成熟 脂肪 細胞 の細 胞質 に局 在し てい るこ とが 証明された。以上より、脂肪細胞はMIF遺伝子 を発 現しMIF蛋白質 を合 成し てお り、 産生 され たMIFは脂 肪細 胞の 細胞 質に蓄積してい ると考えられる。
次 に我 々は 、脂 肪細 胞で 産生 され るMIFが細胞外に分泌されるかどうかを3T3‑L1脂肪 細 胞 を 用 い て 検討 した 。5 xi06個の3T3‑L1脂 肪細 胞を5mlの メデ イウ ムで 培養 し、 メ デ ィ ウ ム 中 のMIF濃 度 をELISAで 測 定 し た 。24時間 後の メデ ィウ ム中MIF濃 度は1.6土 0.5 ng/ml (mean土SD，n=ニ5）であった。したがって脂肪細胞で産生されたMIFの一部は細 胞外 へ分 泌さ れる と思 われ た。 さら に我 々は、 脂肪 細胞 のMIF分 泌に 及ぼすTNF の効 果 も 同 時 に 検 討し た。 ヒト リコ ンビ ナン トTNFaを 最終 濃度50 nMでメ ディ ウム 中に 添 加した場合、24時間後のメディウム中MIF濃度は9.7土2.8 ng/ml (mean士SD，n=ニ5）に増 加 し 、TNF を 添 加 し な い 場 合 に 比 べ て 有 意 に 上 昇 し た ＠ く0.0 01） 。 脂 肪細 胞でMIFが 発現 して いる こと を証 明したのは今回の報告が初めてである。近年 MIFの生 理作 用は今 まで 想像 され てい た以 上に多彩であると考えられるようになった。
MIFは単 に炎 症性サ イト カイ ンで ある ばか りではなく、下垂体ホルモンでもあり、また グルココルチコイドにより誘導される免疫調節因子としての働きも持つ。また極く最近、
Waeber等 はMIFが膵p細 胞か らグ ルコ ース 濃度依 存性 に合 成分 泌さ れ、 さらに分泌され たMIFは オー トクラ イン に作 用し てp細胞 からの イン スリ ン分 泌を 刺激 すると報告して いる 。し たが って 脂肪 細胞 にお いて 産生 分泌されるMIFも生体の糖脂質代謝に影響して いる可能性は十分に考えられる。
今 回 の 研 究 でも うー つ明 らか にな った こと は、 脂肪 細胞か らのMIF分泌 がTNFaに よ り誘 導さ れる とぃ うこ とで ある 。冒 頭で も述べ たよ うに 、脂 肪組 織に おけるTNFdの産 生亢進はオートクラインあるいはバラクラインに作用して、末f肖組織（筋肉・脂肪組織）
で の イ ン ス リ ン抵 抗性 を惹 起す る。 一方 でMIFはマ クロ ファ ージ から のTNFa分 泌を 刺 激 す る こ と が 知ら れて いる ので 、脂 肪組 織に おい てもMIFとTNFdとは 局所 でお 互い に 協 同 的 に 働 い て イ ン ス リ ン 抵 抗 性 の 発 現 に 関 与 し て い る 可 能 性 が あ る 。 肥 満 はNIDDM、 高 血圧 、虚 血性心 疾患 など 多く の成 人病 の危 険因 子と して 臨床 上重 要
であり、またこれらに共通の基盤としてインスリン抵抗性の存在が関心を集めている。
したがって今後、脂肪細胞で発現しているMIFがインスリン抵抗性あるいは糖脂質代謝 に生体内でどの様に関わっているのかについてさらに研究をすすめることは、肥満の病 態 の 解 明 に 新 し い 道 を 開 く も の と し て 意 義 の あ る こ と と 思 わ れ る 。
学 位 論 文 審 査 の 要旨
学位論文題名
Identification of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Adipose Tissue and Its Induction by Tumor Necrosis Factor‑ a
（ 脂肪 組織 にお ける マク ロフ ァ― ジ遊 走阻 止因子の同定と 腫 瘍壊 死因 子aによる その 誘導 ）
肥 満は 脂肪 細胞 の数 と大 きさ の増 加に より脂 肪組織が肥大した状態であり、糖尿病、
高血圧、虚血性心疾患などとの関連が臨床上注目されている。脂肪組織は単にェネルギー を脂肪として蓄積するだけの臓器ではなく、様々な生理活性物質を分泌する組織である こ とが 最近 の研 究により明らかとなった。これらの物質のうちでも特にTNF口は、肥満 時の脂肪細胞で過剰発現しており、肥満や糖尿病に伴うインスリン抵抗性の発現におい て重要な役割を果たしていると考えられている。
マクロファージ遊走阻止因子(macrophage migration inhibitory factor、以下M[F）は 当 初マ クロ ファ ージの遊走を阻止するTリンバ球由来のサイトカインとして同定され、
マクロファージを炎症部位に集める免疫機能を持っと考えられてきた。しかしその後の 研究によりその生理作用は免疫応答のみにとどまらない可能性が示唆されている。上述 の 如く 肥満 時に は脂 肪細 胞で のTNF口産 生は 亢進しているが、TNFぱはマクロファージ か らのMIF分泌を 促進 する と報 告さ れて いる 。本研究では脂肪細胞におけるMIFの発現 及ぴTNFaによるその変化について検討した。
ノー ザン ブ口 ッテ イン グに より 、ラ ヅト脂 肪組織及び3T3 ‑11脂肪細胞においてMIF mRNAの 発現 が認 めら れた 。ウ ェス タン ブロッ テイングでは、ラット脂肪組織及ぴマウ ス3T3‑L1脂 肪細 胞の両者でMIF蛋白質が同定された。ラット脂肪組織の免疫組織染色に お い て も 、MIF蛋 白 質は 成 熟 脂 肪 細 胞 の 細 胞 質 に 局 在し てい るこ とが 証明 された 。 次に 、脂 肪細 胞で産生されるMIFが細胞外に分泌されるかどうかを3T3‑L1脂肪細胞を 用 いて 検討 した 。5 xi06個の3T3‑L1脂 肪細胞 を5mlの メデ ィウ ムで 培養し 、メディウ ム 中のMIF濃度を 測定した。24時間後のメディウム中Ml[F濃度は1.6土0.5 ng/ml (mean
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土SD，n=5)で あっ た。したがって脂肪細胞で産生されたMIFの一部は細胞外ヘ分泌され ると 考え られ た。 さら にTNFaを最 終濃 度50 nMでメ ディウ ム中 に添 加し た場 合、24時 間後のメディウム中MIF濃度は9.7土2.8 ng/ml (mean土SD，n二ニ5）に増加し、TNF口を添 加しない場合に比べて有意に上昇した＠く0.001）。
脂肪 細胞 でMIFが発 現し てい るこ とを 証明 した のは 今回の 報告 が初 めて であ る。極く 最近 、MIFは膵p細 胞か らグル コー ス濃 度依 存性 に合成分泌され、オートクラインに作 用し てp細 胞か らの インスリン分泌を刺激すると報告されている。したがって脂肪細胞 にお いて 産生 分泌 されるMIFも生体の糖・脂質代謝に影響している可能性は十分に考え られる。今回の研究でもうーつ明らかになったことは、脂肪細胞からのMIF分泌/JsT NF 口に より 誘導 され るということである。脂肪組織におけるTNF口の産生亢進はオートク ラインあるいはバラクラインに作用して、末梢組織（筋肉・脂肪組織）でのインスリン 抵抗 性を 惹起 する 。一 方でMIFは マク 口フ ァー ジからのTNFぱ分泌を刺激することが知 られ てい るの で、 脂肪 組織に おい てもM[FとTNFaと は局所 でお 互い に協 同的 に働いて インスリン抵抗性の発現に関与している可能性が示唆される。
審査 に当 たっ ては 、皆川 教授 より 、TNF口 以外のサイトカインとMIFとの関連につい て 、肥 満に おけ るTNF口過 剰発 現の 意義 につ いて 質問が あっ た。 また 副査 西教授より MIFのク ロー ニン グ法・酵素活性・マク口ファージ遊走阻止活性について、他臓器にお けるMIF発現について、MIFとエンドトキシンショックとの関連について質問があった。
ま た副 査川 上教 授より、TNFば以外のインスリン抵抗性誘導因子について、脂肪細胞か ら分泌される物質を肥満時に測定する際の標準化について質問があった。さらに主査石 橋 より 、MIFのア ッセ イ法 につ いて 、脂 肪細 胞においてMIFを研究対象とした理由につ い て、TNF口 によ るMIF誘導 作用 の濃 度依 存性 につ いて 、悪 性腫 瘍と 糖尿 病とでのTNF ぱ発現の意義の相違について質問があった。申請者はこれらのいずれの質問に対しても 適切な回答をおこなった。
さら に、 脂肪 細胞で発現しているMIFがインスリン抵抗性あるいは糖代謝・脂質代謝 に生体内で実際にどの様に関わっているのかについて研究をすすめることにより、肥満 の 病 態 に お け るMIFの 役 割 を さ ら に 解 明 す る こ と が で き る と 期 待 さ れ る 。 審 査員 一同 は、 本研究を脂肪細胞におけるインスリン抵抗性にMIFが関与していること を示唆する研究として高く評価し、博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有す るものと判定した。
