博士（医学）森 清 学位論文題名
自 己 免 疫 疾 患 発 症 モ デ ル MRL ／ Mp ― lpr ／ lpr マ ウ ス (t: おける Eta‑l (Early T lymphocyte activation ‑ 1)
の 発 現 と そ の 作 用 に 関 す る 研究
Studies on Expression and Function of Eta‑l (Early T Lymphocyte Activation‑l) in autoimmune prone M R L/Mp‑Ipr/lpr mice
学 位 論 文 内 容 の要 旨
は じめに
自 己 免 疫 疾 患 発 症 モ デ ル マ ウ ス で あ る MRLf Mp．lpr′ ゆ （M心4pr） マ ウ ス は 恥 田 胞 活性化 、自己抗体の産生 、腎炎などSり様症状を8ずを。MR磁憾 空リイパ球の主
体はCD4．CD8‐CD45R十のT細胞（DNT細胞）である。 本研究ではゝこの
DNT細 胞 が サ イ ト カ イ ン で あ る Eぬ ‐1（EaめTlymphocyやapdvadon‐1） を 発 現 し て いるこ とと、Eぬー1のB細胞活性化 との関連とにっ丶 ゝて検討した。
材 料と方法 1．マウス
2か ら4ケ 月 齢 の 雌 を 使 用 し た 。MR工 刀prお よ ぴC57BL6/J―lp肌pr（B6nPr） はJackson loboratoヴ よ り 入 手 し 、MRL‐ 十/十 （MRIれ ） ；B6，Balb／cは 静 岡 動 物 セ ン タ ー か ら 入 手 し使用 し た。
2．細胞分離 ， ．・ …．．↓ ・↓‥
■ACStar（BectonDicbnson） に よ っ て 、 抗 CD4抗 体 、 抗CD8抗 体 、 抗CD45R抗 体 、 抗sIg抗体を用 いてCD4T細胞およぴDNT細胞 を収集した。
3．Re品rSeTranSCripぬSe−POlymeraSeChainReaCtion（RT−PCR）
IL−1a，IL．2，IL‐・3，IL‐4，Ic5，IL−6，IL‐7，IL−10，IFN―ア，TNFーa，TNFッ，TG．．F−p，Eta− 1，CD4，Cる8，C645長 ，Mag−1，p ‐acti五 に る ぃ て 妄nmer´ を 作 製 しCD4で 細 胞 お よ び DNT細胞のサイ トカイシ遺伝子発現 を検索した。
4．Eぬ ―1の精 製 ，
陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム （DE52カ ラ ム ） お よ ぴ ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト カ ラ ム （Sephadex‐ G150カ ラム）を用いてヒ ト初乳よりEta―1を精製した。 ．
5．Eta‐1の検 出法
血清 に等容量のクエン 酸バリウムを混和 吸着させ、蒸留水で 洗浄後、O．2M92
エ ン 酸 ナ ト 1´ ウ ム を 含 むSDSサ ン プ ル ′/ヾ ッ フ ァ ー に 溶 出 さ せ 、SDS‐PAGEに 電 気 泳 動 を 行 っ た 。 ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ ト 後 、 ウ サ ギ 抗 Eぬ −1抗 体 お よ ぴ べ ル オ キ ニ ノ ダ ー ゼ 標 識 ヤ ギ 抗 ウ サ ギ 抗 体 で 免 疫 染 色 を し 、 発 色 に ， は ジ ア ミ ノ ベ ン チ ジ ン を 用 い た 。 6．抗体産生
而 最Lハprお よ びMRL／ 十 の 脾 細 胞 よ り 、 抗ThV1．2抗 体 お よ ぴ ウ サ ギ 血 清 を 用 い てT ー245 ‑
結果
l.MRIJlpr 脾細胞における各種サイトカインmRNA の発現
MRL/lpr 、 MRL/+ の CD4T 細胞お よび DNT 細 胞は 98 ％以上 の純度で収 集するこ と が でき た 。 1V1Rl̲4lpl の CD4T 細胞は IL‑1a ， IL‑6 ，IFN‑ ・‑a ， TN mRNA の発現が認められたちミ、MRL 十のCD4T 細胞では認めアら 琵雲かっ麗．＆恕の DNT 細胞では Eta‑l の発現は認められたが、 IL‑1a ，IL‑4 ，1L‑5 ，I し 6 のmRNA の現 は認められなかった。
2.Eta‑1 の精製
ヒト初乳lOQml より Eta‑l を ；収集することができた。
3.Eta ‐1 の抗体産生におよぼす諺聖g
MRIJI pr および MRL/+ の脾細胞より95 ％以上の純度の B 細胞を得た。BCLl (in vivo) は 99 ％ 以 上 の純 度 であ っ た。 A I 胞 では Eta ー 1 を 加 え るこ と によ り IgM の 産 生は 25 倍に 増 加し た。 MR 諤溜醫黐麗 鴛も同様の 傾向が認め られた。
BCLl でも同様の傾向を示したが、このEta ー1 の作用はRMV −7 によってコントロール レベルにまで抑制された。
4 ．lpr マウス血清中のE ぬ―1
M 心朋pr およびB 印pr では54K およぴ28K のEta ‐1 を認めたが、Balb/c ，B6 では認めら れなからたもまた生後11 日、17 日のB 叩pr 血清中には 54K のEta ‐1 を認めたが、 28K のE ほ−1 は認められなかった。
馴攤を織℃い媛奄縦嫐；＃をするEtaIl はMRL/lpr のBE 免疫
―246―
学位 論 文 審 査の 要 旨
学 位 論 文 題 名
自 己 免 疫 疾 患 発 症 モ デ ル MRL ／ lVIp − lpr ／ lpr マ ウ ス に+S ける Eta‑l (Early T lymphocyte activation ‑ 1)
の 発 現 とそ の 作 用 に関 す る 研 究
Studies on Expression and Function of Eta‑l (Early T Lymphocyte Activation‑l) in autoimmune prone M R LZ Mp‑Ipr ／1pr mice
I．目的
自 己 免 疫 疾患 発 症 モデ ル マ ウス で あ るMRL[Mp‑lpr/lpr(MRL/lpr)マ ウス はB細胞 活 性 化 、 腎 炎 な どSLE様 症 状 を 呈 す る 。MRL/lprの り ン パ 球 の 主 体 はCD4―CD8‑CD45R十 のT細 胞 （DNT細 胞 ） で あ る 。 本 研 究 で は 、 こ のDNT細 胞 が サ イ ト カ イ ン で あ る Eta‑l (Early Tlymphocyte activation‑l）を発現していることと、Etaー1のB細胞活性化と の関連について検討した。
II．材料と方法 1．マウス
2〜4ケ月齢の雌のMRIーflpr，MRIーI十／十（MRソ十），C57BL6/J‑lpr/lpr(B6flpr)，B6，Balb/c， NZB/NZW‑F1を使用した。
2．細胞分離
FACStarによって、CD4T細胞およびDNT細胞を回収した。
3.Reverse Transcriptase‑Polymerase Chain Reaction(RT‑PCR)
IL‑1a，IL‑2，IL‑3，IL‑4，IL‑5，IL‑6，IL‑7，IL‑10，IFN‑ア，TNF‑a，TNF‑p，TGF‑p，Eta‑
1，CD4，CD8，CD45R，Mac‑l，p‑actinに つい てprimerを 作 製 しCD4T細 胞お よびDNT細胞 のサイトカイン遺伝子発現を検索した。
―247一
保彦 紀 邦知 崎林 川 宮 小 皆 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
4.Eta‑lの精 製
陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム(DE52カ ラ ム ） お よ び ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト カ ラ ム(Sephadex‑G 150カラ ム）を用 いてヒ ト初乳よ りEta‑lを精製し た。
5.Eta‑lの検 出法
ク エ ン酸 バ リ ウム 吸 着 濃縮 法 お よび ウ ェ スタ ン ブ ロ ット 法 に より 血清中のEta‑lを 検 出した。
6．抗 体産生
MRL/lprお よ びMRL/+の 脾 細 胞 よ りT細 胞 を除 去 し 、B細 胞 を 得た 。BCLl(in vivo)細 胞は常法 によって 得た。B細胞 をりポ 多糖(LPS)O.1メg/ml，Eta‑l(ひ10メg/ml)，抗マウス ヴ ィ ト 口 ネ ク チ ン レ セ プ タ ー 抗 体(RMV‑7) (O‑‑lOUg/ml)と 共 培 養 し 、IgMを 測 定 (ELISA法）し た。
III.結果
1.MRI，/lpr脾細胞における各種サイトカインmRNAの発現
CD4T細 胞 お よ びDNT細 胞 は98％ 以 上 の 純 度 で 回 収 で き た 。 MRL八prのDNT細 胞ではEta‐1の発現は認められたが、IL‐1 ，IL‐4，IL‐5，ILー6は認められなかった。CD4 T細胞ではEta゛1の発現は認められなかった。
2．Eぬ‐1の精製
ヒト初乳100mlよりEぬ．1を1．98mg収集することができた。
3．Eぬ‐1の抗体産生におよぼす影響
MRI． 冂prお よぴMRリ十 の脾 細胞より95％以上 の純度のB細胞 を得た 。BCL1（invivo） は99％ 以 上 の 純 度 で あ っ た 。MRLnprのB細 胞 で はE仏 ‐1を 加 える こ と によ りIgMの 産 生 は25倍 に 増加 し た 。MRI/十 のB細胞 で も 、BCL1でも 同 様 の傾 向 を 示し た 。 このEぬ ． 1の作用はRMV−7によってコントロールレベルにまで抑制された。
4．1prマウス血清中のEぬ‐1
MRL八prおよ びB6凡prでは54Kお よび28KのEぬ ‐1を認めた が、B甜b/c，B6では認 められ な か っ た 。 一 方 、 生 後11日、17日 のB6npr血 清 中に は54KのEぬ‐1を 認め た が 、28Kの Eぬ‐1は認めなかった。
IV.考察
MRL[lprの り ンパ 球 の80％を 占めるDNT細胞 はIL‑4，IL‑5，IL‑6の遺伝 子を発現 してい な か った が 、B細胞 を 活 性化 す る サイ ト カ イン で あ るEta‑lを 常 に 分泌 し て いた 。更 に こ のEta‑lの機 能 を 検討 す る ため 、Eta‑lを精 製 しB細 胞 の 活 性化 を 測 定し た 。Eta‑lは B細 胞 を 活 性 化 す る が 、 こ の 作 用 は ヴ ィ ト 口 ネ ク チ ン レ セ プ タ ー （VNR)に 対 す る 抗 体 で 抑 制 さ れ た 。 マ ク ロ フ ァ ー ジ はLPSに よ っ てVNRを発 現 す るこ と と 、Eta―1はRG D接 着ア ミ ノ 酸 配列 に よ って マ ク ロフ ァ ー ジに 接 着 する こ と が知 ら れ て いる 。Eta‑lは マ ク 口 フ ァ ー ジ 上 のVNRを 介 して 刺 激 を与 え 、 マク ロ フ ァ ージ が 分 泌す る サ イト カ イ ン ま たは 細 胞 間 シグ ナ ル によ りB細胞 を 活 性化 し た と考 え ら れた 。 一 方 、Eta‑lは正 常 マ ウ ス 血 清 中 に は ほ と んど 認 め られ な か った が 、MRL[lprの 血 清中 に は 多量 に 存 在し た 。IL‑6がMRL/lpr血 清中 で3〜6ケ 月 齢で 上 昇 する こ とが 知られて いるが 、それに 先行
‑ 248―
