博士（医学）中川憲一 学位論文題名
ロヶノaly マウスにおけるNK1 ．1 ゛T 細胞の欠損と胸腺構築
学位論文内容の要旨
は じ め に
胸 腺 細 胞 の 中 にT cell antigen receptor (TCR) ap鎖 を 細 胞 表 面 上 に 発 現 し 、 か つnatural killer (NK) 細 胞 特 異 的 抗 原 で あ るNKl.1を 発 現 す る ユ ニ ー ク な 細 胞 亜 群(NK‑T細 胞 ） が 存 在 す る 。 NK‑T 細 胞 は 通 常 の 胸 腺 細 胞 と は 異 な り 、CD4'CD8‑細 胞 とCD4゛CD8‑細 胞 の み か ら 構 成 さ れ る 。 ま た TCRp鎖 で は 50%以 上 の 細 胞 がvp8を 発 現 す る ほ か 、vp7、vp2の 発 現 が 主 で 、a鎖 で は 主 と し て Va14‑Ja281を 発 現 す る な ど 、 他 の メ ジ ャ ー な 胸 腺 細 胞 と 比 べ て 非 常 に 偏 っ たTCRレ バ ー ト リ ー を 形 成 し て い る 。 細 胞 表 面 抗 原 の 発 現 パ 夕 一 ン は 、 一 度 活 性 化 さ れ た メ モ リ ー 型T細 胞 の タ イ プ に 類 似 し て い る 。 組 織 分 布 で は 、 胸 腺 以 外 に 骨 髄 、 肝 臓 に 多 く 認 め ら れ 、 成 熟 型T細 胞 の10
〜30%を 占 め る が 、 脾 臓 で は1％ 内 外 、 リ ン パ 節 に は ほ と ん ど 認 め ら れ な い 。 ま た 、NK‑T細 胞 は 、 通 常 のT細 胞 が 正 の 選 択 を 受 け る 胸 腺 上 皮 細 胞 で は な く 、CD4℃D8゛ 胸 腺 細 胞 上 のCD1分 子 に よ っ て 正 の 選 択 を 受 け る と さ れ て い る 。 こ の よ う にNK‑T細 胞 は 、 通 常 のT細 胞 と は 細 胞 系 列 が 異 な る 亜 群 と 考 え ら れ る が 、 そ の 詳 細 に つ い て は 不 明 な 点 が 多 い 。 最 近 の 報 告 で は 、 自 己 免 疫 疾 患 と の 関 連 でlprマ ウ ス や ヒ ト の 多 発 性 硬 化 症 の 際 に 、NK‑T細 胞 が 病 態 の 進 行 に 伴 っ て 減 少 す る こ と が 明 ら か に さ れ 、 注 目 さ れ て い る 。
今 回 、 申 請 者 は り ン パ 節 と バ イ エ ル 板 を 完 全 に 欠 損 す る ロ ヶ ′ ロ ヶ(alymphoplasiaの 略 ） マ ウ ス の NK‑T細 胞 を 解 析 し 、 こ の マ ウ ス に 、 はNK‑T細 胞 が ほ と ん ど 存 在 し な い こ と を 見 い だ し 、 ま た ロ リ ロ ヶ マ ウ ス に お け るNK‑T細 胞 の 分 化 に つ い て 検 討 し た 。
結果
ロ ヶ ノ ロ ヶ マ ウ ス の 胸 腺 細 胞 を 抗TCRap抗 体 と 抗NKl.1抗 体 で 染 色 し てFACSで 解 析 す る と 、NK‑
T細 胞 の 割 合 は 胸 腺 細 胞 全 体 の0.05％ で あ り 、 ロ ヅ 十 、B6マ ウ ス の0.61％ 、0.75％ と 比 べ て 極 端 に 少 な い こ と が 判 明 し た 。 脾 臓 、 骨 髄 に お い て も 、NK‑T細 胞 の 割 合 は ロ リ 十 、B6マ ウ ス と 比 べ て 約lf2〜1/4程 度 で あ っ た 。 ま た 、 実 数 に お い て もalylalyマ ウ ス で はNK‑T細 胞 が 減 少 し て い た 。 ロ ヶ ′ ロ ル マ ウ ス に お け る 胸 腺 内NK‑T細 胞 数 の 低 下 の 原 因 が 骨 髄 由 来 の 前 駆 細 胞 側 に あ る の か 、 そ れ と も 胸 腺 内 微 小 環 境 側 に あ る の か を 調 べ る た め に 、 ロ ら ′laly、 ロ ヅ 十 マ ウ ス 間 で 骨 髄 移 植 実 験 を 行 った。 その 結果、 ロル／ 十マウスをレシピェントとした［甜ッ／十→ロly!十］、［甜ッ／甜ッ→甜ッ′十］キメラマ ウ ス に は 、 通 常 の 割 合 の 胸 腺 内NK‑T細 胞 が 認 め ら れ た の に 対 し て 、 甜 ッ ′ 甜 ッ を レ シ ピ ェ ン ト とし た ［ 甜 ッ ′十 → 甜 ッlaly］ 、 ［甜 ッ ／ 甜 ッ → 甜ッ ／ 甜 ッ ］ キメ ラ マ ウ ス の胸 腺 内NK‑T細 胞 数 は 、前 者の
1/8〜1／10程 度 で あ る こ と が 判 明し た 。 従 っ て 、aly／ 甜 ッ 、 ロlyl十 マ ウ スの 何 れ のNK‑T細 胞 の 前 駆 細 胞 も 、 正 常 な 胸 腺 の 中 で はNK‑T細 胞 に 分 化 し う る こ と が 示 唆 さ れ 、aly／ 甜 ッ マ ウ ス の 胸 腺 内NK‑T細 胞 が ほ と ん ど 存 在 し な い の は 、 甜 ッlalyマ ウ ス の 胸 腺 内 微 小 環 境 の 異 常 に よ る も の と 考 え ら れ た 。 そ こ で 、 胸 腺 内 微 小 環 境 の 役 割 を 直 接 確 認 す る た め に 、 生 後 5週 で 胸 腺 摘 出 （ATx） し たaly／ 甜 ッ マ ウ ス に 致 死 量 の 放 射 線 を 照 射 し 、 甜 ッ ′aly骨 髄 細 胞 で 再 建 し た ［ 甜y′ 甜 ッ → ATx. alylaly］ キ メ ラマ ウ ス を 作製 し た 。 こ の キ メラ の 腎 皮 膜下 に 、 デ オ キ シ グ ア ノ シ ン で 処 理 し て 骨 髄 由 来 細 胞 を 除 去 し た 正 常 マ ウ ス の 胎 児 胸 腺 を 移 植 し た 。 そ の 結 果 、 甜 ッ ′ 甜 ッ 骨 髄 由 来 細 胞 が 正 常 マ ウ ス 胎 児 胸 腺 内 で 胸 腺 細 胞 へ と 分 化 し 、 移 植 後10 週 で は 正 常 胸 腺 と 同 程 度 に 全 胸 腺 中 の0.9ゲ 。 がNK‑T細 胞 で あ る こ と が 判 明 し た 。 従 っ て 、 NK‑T細胞の分化には正常な胸腺の存在が必須であることが示された。
甜 ッ ′ 甜 ッ マ ウ ス の 胸 腺 を 組 織 学 的 に 甜 ッ ′ 十 マ ウ ス と 比 較 し て 検 討 し て み る と 、 正 常 の 構築 を 示 す 甜 ッ ／ 十 マ ウ ス 胸 腺 に 対 し て 、alylalyマ ウ ス の 胸 腺 は 髄 質 領 域 が 極 め て 狭 小 で あ り 、 皮 髄 境 界 が 不 明 瞭 で あ っ た 。 ま た 、 胸 腺 皮 質 上 皮 細 胞 、 ， 髄 質 上 皮 細 胞 に 特 異 的 な 抗 体 で あ るER‑TR4、ER‑TR5で そ れ ぞ れ 免 疫 染 色 を し て み る と 、 甜 ッ ′ 十 マ ウ ス と 比 べ てalylalyマ ウ ス 胸 腺 で は 皮 質 領 域 がER ‑TR4で 強 く 染 色 さ れ た が 、 髄 質 領 域 のER ‑TR5に よ る 染 色 は 微 弱 で あ っ た 。 次 に 、 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス の 胸 腺 を 組 織 学 的 に 見 る と、[alylロル → 甜 ッ ′十 ］ キ メ ラ マ ウス で は 甜 ッ／ 十 マ ウ スと 同 様 に 正常 な 胸 腺 構築 を 示し たが、[alyl十→ 甜ッ′ 甜ッ］ キメラマ ウ ス で は 狭 小 な 髄 質 と 不 明 瞭 な 皮 髄 境 界 が 認 め ら れ 、alylalyマ ウ ス の 胸 腺 と 同 様 の 組 織 像 を 呈 し た 。 こ れ ら の 組 織 像 か ら 甜 ッlalyマ ウ ス 胸 腺 の 構 築 異 常 は 、 胸 腺 上 皮 細 胞 そ の も の の 異 常 に 起 因 す る も の で 、 こ の 異 常 は 正 常 胸 腺 細 胞 に よ る 再 建 に よ っ て 修 復 さ れ な い こ と が判明した。
B6な ど の 正 常 マ ウ ス で は 、 抗 CD3抗 体 （2C11） の 静 脈 内 投 与 短 時 間 （90分 ） 後 に 脾 細 胞 が 大 量 のIL‑4を 分 泌 す る こ と 、 こ のIL‑4産 生 はNK‑T細 胞 に よ る こ と が 知 ら れ て い る 。 そ こ で 、NK‑T細 胞 が 少 な いalyl甜 ッ マ ウ ス で は ど の よ う な 反 応 性 を 示 す か をB6、aly′ 十 マ ウ ス と 比 較 し た 。 そ の 結 果 、2C11投 与 に よ っ て 甜 ッ ′ 十 マ ウ ス 脾 細 胞 はB6マ ウ ス と 同 程 度 の 11‑4を 産 生 し た が 、aly′ 甜 ッ マ ウ ス で は ほ と ん どIL‑4産 生 が 認め ら れ な かっ た 。 ま た、 甜 ッlaly をレ シピェ ントと した[aly′ 十→ロ ル′ロ ル］、[atylaly→alylロly］キ メラマウ スでも 、IL‑4の産生が ほとんど認められず、ロル′十をレシピェントとした[alyr十→甜ッ′十］、［甜ッ′甜ッ→甜ッ′十］キメラマ ウ ス の1/3〜1/7程 度 で あ っ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、IL‑4産 生 能 低 下 とNK、T細 胞 数 減 少 が 相 関 す る こ と を 示 す 。 し か し 、11‑4産 生 能 はalylalyマ ウ ス の 脾 臓 内NK‑T細 胞 数 の 減 少 か ら 予 想 さ れ る 値 よ り も さ ら に 下 回 っ て お り 、 甜 ッlalyマ ウ ス のNK‑T細 胞 は 細 胞 数 が 少 な いのみならず、機能的にも不完全であることが判明した。
考察
alyl ロルマウスの異常は常染色体劣性遺伝形式をとり、リンパ節、バイエル板の欠損以外
に胸 腺、 脾臓 に構 造的 な異 常を 示すと 報告 され ている。 また、血清IgA 、IgG がほとん
ど検 出さ れず 、同 種皮膚移植片の拒絶不全や遅延型過敏反応の減弱が見られるなど、B 細
胞とT 細胞の両者に異常があると考えられている。 しかし、in vitro のりンバ球反応はほ
ぼ正常であるなど免疫学的には解明すべきことが多い。 ヘテロ接合体のロル′十マウスは 見かけ上正常である。 今回、主として甜ッ′甜ッマウスとロヶ／十マウスを用いてNK‑T 細胞の 分化と胸腺の構築異常の関係を解析した。 その結果、甜ッ′甜ッマウスには胸腺内NK‑T 細 胞 がほ とんど存在せず、胸腺上皮細胞、特に髄質上皮に異常を示すことが判明した。 ま た 、こ の原因はNK‑T 細胞の骨髄由来前駆細胞側ではなく胸腺内微小環境側にあることが、
甜ッlaly マウスとロヶ′十マウスとの間の骨髄移植実験と胸I 腺移植実験によって明らかになっ た 。 本研 究は、
NK‑T細胞 の分 化に は骨 髄由 来細 胞だ けで はな く、正常な胸腺上皮細胞 も 必要 であ ること を初 めて 示し た。
現 在、
NK‑T細胞 異常 と自 己免疫疾患などの関連が 世 界的 に注目を集めているが、今回の発見はこれらの疾患の病因を追求していく上で重要 と考えられる。
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授
副査 教授 小野江和則 上 出 利 光
副 査
教 授
小 池 隆 夫
学 位 論 文 題 名
ロヶ ノ aly マウスにおける NKl.1+T 細胞の欠損と胸腺構築
胸腺細 胞の中にT cellantigen recept,or(TCR）ap鎖を細胞表面上に発現し、かつn趾ural killer (NK)細 胞 特 異 的 抗 原 で あ るNKl.1を 発 現 す る ユ ニ ー ク な 細 胞 亜 群 （NK‑T細 胞 ） が 約1％ 存 在 す る 。 NK‑T細 胞 は 、 通 常 のT細 胞 が 正 の 選 択 を 受 け る 胸 腺 上 皮 細 胞 で は な く 、 CD4十CD8゛ 胸 腺 細 胞 上 のCD1分 子 に よ っ て 正 の 選 択 を 受 け る こ と か ら 、 通 常 のT細 胞 と は 細 胞 系 列 が 異 な る 亜 群 と 考 え ら れ る が 、 そ の 詳 細 に つ い て は 不 明 な 点 が 多い 。 今回 、 申 請者 は り ン バ節 と パ イ エル 板 を 完全に 欠損す るロル ′ロヶ （alymphoplasiaの 略）マ ウスに おけ るNK‑T細胞の分化について検討した。
ロ ヶ ノロ ヶ マ ウ スの 胸 腺NK‑T細 胞 の割 合 は 、 胸腺 細 胞 全体の0.05%であり 、aly′十 、B6マウ ス と 比 べ て 極 端 に 少 な か っ た 。 脾 臓 、 骨 髄に お い て も、NK‑T細 胞 の 割 合はaly／ 十 、B6マ ウスと比べて約1/2〜1/4程度であった。
ロ ヶ ／ ロ ヶ マ ウス に お け る胸 腺 内NK‑T細 胞数 の 低 下 の原 因 が 骨 髄由 来 の 前 駆細 胞 側 に ある のか、そ れとも 胸腺内 微小環 境側に あるの かを調 べるた めに、ロヶ／ロヶヽロヶ／十マウス間で骨 髄移植実験を行った。 その結果、ロヶ／十マウスをレシピェントとした［ロヶ′ロヶ→ロヶ／十］キメ ラ マ ウ ス に は 、 通 常の 割 合 の 胸腺 内NK‑T細 胞 が認 め ら れ たの に 対 し て、 ロ ヶ ′ ロヶ を レ シ ピ エントと した［ ロヶ／ 十→ aly／ロヶ］ 、キメ ラマウ スの胸腺内NK‑T細胞は、前者の1/10程度であ ることが判明した。
次 に 胸 腺 内 微 小環 境 の 役 割を 直 接 確 認す る た め に、 胸 腺 摘 出（ATx） し たaly′ ロ ヶ マウ ス に致死量の放射線を照射し、ロヶ／ロヶ骨髄細胞で再建した［ロル／ロヶ→ ATx.ロルlaly］キメラマウ ス を 作 製 し た 。 こ の キ メ ラ の 腎 被 膜 下 に 、 デ オ キ シ グ ア ノ シ ン で 処 理し た 正 常 マウ ス の 胎 児 胸 腺 を 移 植 し た。 10週 後 に 移植 胸 腺 内 には 、 正 常 胸腺 と 同 程 度の 割 合 の ロヶ ／ ロ ヶ 骨 髄 由 来NK‑T細 胞 が 認 め ら れ た 。 従 っ てNK‑T細 胞 の 分 化 に は 、 正 常 胸 腺 が 必 須 で あ る こ とカ｜判明した。
aly／ ロ ヶマ ウ ス ， の胸 腺 は 髄質 領域が 極めて 狭小であ り、皮 髄境界 が不明 瞭であ った。 胸 腺 皮 質 上 皮 細 胞 、 髄質 上 皮 細 胞に 特 異 的 な抗 体 で あ るER． ′IR4、ER‑ IR5で そ れ ぞれ 免 疫 染 色を し てみ ると、 ロヶ／十 マウス と比べ てロヶ ／ロヶ マウス 胸腺で は髄質 領域のER‑TR5による 染 色が微弱であった。 また［ロヶ／ロル→ロヶ／十］キメラマウスではロヶ／十マウスと同様に正常な胸 腺構築を示したが、［ロヶ′十→ロヶ′ロヶ］キメラマウスではロヶ′ロヶマウスの胸腺と同様の組織像 を呈 し た 。 こ れ らの 組 織 像 から ロ ル ／ ロヶ マ ウ ス 胸腺 の構 築異常 は、胸 腺髄質 上皮細 胞その ものの異常に起因することが半I明した。
次 に 、ロ ヶ ／ ロ ルマ ウ ス に 抗CD3抗 体 （2Cll） を静 注 し 、 どの よ う な 反応 性 を 示すか をB6、 ロヶ ′ 十 マ ウス と 比 較 した 。 そ の 結 果 、2C11投与 に よ ってロ ヶ／十マ ウス脾 内NK‑T細 胞はB6
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マ ウ ス と 同 程 度 のIL‑4を 産 生 し た が 、 ロ ヶlalyマ ウス で はほ とん どIL‑4産生 が認 めら れな か っ た。 また、ロヶlalyをレシピェントとした［aly／十→ロル／ロヶ］キメラマウスでも、IL‑4の産 生がほとんど認められず、ロヶ／十をレシピェントとした【aly／ロヶ→ロヶノ十］キメラマウスの1/3
〜l〃 程 度 で あ っ た 。 こ れら の結 果 から 、IL‑4産 生能 低 下は ロヶ ／ロ ヶ マウ スの 脾内NK‑T細 胞 数の減少のみならず、機能 的分化異常によることが判明 した。
本 研 究 は 、NK‑T細 胞 の 分 化 に は 骨 髄 由 来 細 胞 だ け で は な く 、 正 常 な 胸 腺 上 皮 細 胞 も 必 要 で あ る こ と を 初 め て 示 し た 。 現 在 、NK‑T細 胞 異 常 と 自 己 免 疫 疾 患 の 関 連 が 世 界 的 に 注 目 を 集 め て い る が 、 今 回 の 発 見 は こ れ ら の 疾 患 の 病 因 を 追 求 し て い く 上 で 重 要 と 考 え ら れ る。
公 開 発 表 に あ た っ て 、 副 査 の 上 出 利 光 教 授 か ら 、NK‑T細 胞 の 分 化 に 対 す るCD1分 子 の 役 割 に つ い て の 文 献 的 考 察 、NK‑T細 胞 の 前 駆 細 胞 の ホ ー ミ ン グ 異 常 の 有 無 、 抗CD3抗 体 投 与 に よ るILー4産 生 の マ ウ ス 系 統 差 に つ い て 、 小 池 隆I夫 教 授 か ら 、 胸 腺 と 脾 臓NK‑T細 胞 の 違 い 、 脾 臓NK‑T細 胞 の 機 能 とVa14発 現 に つ い て 、 キ メ ラ に お け る 抗CD3抗 体 に 対 す る 反応 性、 ロヶ ／ ロヶ マウ スに おけ る シェ ーグ レン 等の 自 己免 疫発 症に つ いて 、主 査の小野 江 よ りNK‑T細 胞 の 機 能 と フ ウ ノ タ イ プ の 相 関 に つ い て 質 問 が あ っ た が 、 申 請 者 は 大 概 妥 当 な回答をした。
審 査 員 一 同 は 、 世 界 で 初 め てNK‑T細 胞 の 産 生 と 胸 腺 構 築 の 関 係 を 明 ら か に し た 研 究 成 果 を 高 く 評 価 し 、 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 断 した。
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