博 士 （ 医 学 ） 坂 上 慎 二 学位 論文題 名
Regulation of Macrophage Migration Inhibitory Factor （ MIF) ExpresslonbyGluCOSe andInSulininAdipOCyteSInVitrO
（脂肪細胞におけるブドウ糖とインスリンによる マ クロ フ ァー ジ 遊走 阻 止 因子発現 の制御）
学 位 論文 内 容 の 要旨
マクロファージ遊走阻止因子(macrophage mlgrationinhibitoryfaCtor；MtF）は、当初その名のと お ルマク 口ファ ージの遊 走を阻 害する りンホ カイン として 同定さ れた。 しかし、 近年の研究に よ り、MlFは 生体内 に広く 存在し 、その 作用も炎 症・免 疫を中心として多岐にわたることが明ら か となっ てきて いる。MIFは膵B細 胞にお いても 発現がみ られ、 ブドウ 糖によ るインスリン分泌 増 加 に おい て 重要な 役割を 果たす と報告 された 。この ことは 、糖代 謝におけ るMIFの 重要性 を 示 唆 し てい る 。我々 は、以 前、脂 肪細胞 でもMlFが 発現し ている ことを 見いだ した。 脂肪細 胞 は 種々の 生理活 性物質を 産生・ 分泌し 、イン スリン 非依存 型糖尿病（non・insu‖n‐dependent diabetesme‖itus；NtDDM）の病態に大いに関与している。そこで我々は、培養脂肪細胞と肥満・
糖尿病ラットの脂肪組織を用いて、MlF発現の制御機構を検討した。
方 法と し て は、マ ウス由 来の培養 脂肪細 胞であ る3T3−L1を、種 々の濃度 のブド ウ糖・ イン ス リ ン など の 存 在 下で 培 養 し 、MlFmRNAの 発 現 とMlF蛋 白 の 産 生を そ れ ぞ れNonhembIot法、
enzyme‐｜inkedimmunosorbentassay（ELlSA）法により評価した。肥満・糖尿病モデルラットで あ るOtSukaLOng‐EvansTOkuShimaFatty（OLETF）ラッ ト、Wistarfattyラット の副睾 丸周囲脂 肪 組 織 に お け るMlFmRNAの 発 現 をNonhembIot法 で 評 価 し 、 血 漿 中 のMIF量 をELlSA法 で 測定した。
3T3‐L1脂 肪 細胞 を 、5旧 ／mlの イ ンス リン存在 下に種 々のブ ドウ糖 濃度で24時間培 養した と こ ろ 、ブ ド ウ 糖 濃度 が200mg／dl以 上の と き 、MlFmRNA発現 が 増 強 した 。 し か し、 こ の変 化 は イ ンス リ ン を 加え て い な い場 合 に は みら れ な か った 。 こ のこ とは、MIFmRNA発現に はブ ド ウ糖の みなら ず、イン スリン の関与 が必要 である ことを 示唆していると考え、次に400mg/d｜ の ブドウ 糖存在 下に種々 のイン スリン 濃度で24時間培 養した ところ 、イン ス1」ンが1旧／ml以 上 の と きMlFmRNA発 現 が 増 強し た 。 刺 激時 間 の 検 討で は 、 こ の反 応 は イ ンス ル ン 刺 激8時 間 で 認 め られ た 。 し かし ブ ド ウ 糖が 存 在 し ない と き に はイ ン ス リン によるMIFmRNA発現の 増強 は 認めら れなか った。こ れらの 結果に より、3T3ーL1脂 肪細胞においては、ブドウ糖・インスリ ン に よ る そ れ ぞ れ の 単 独 刺 激 で はMlFmRNA発 現 は変 化 し な いが 、 共 存 下に お い てMlFmRNA の 発 現 が増 強 するこ とが明 らかと なった 。この ことか ら細胞 内への ブドウ糖 の輸送 がMlFmRNA 発現の制御に重要な因子になっていることが推測される。
細 胞 内MlF蛋 白 量 は 、mRNAと 同様 に400mg／dIの ブド ウ 糖 ．5旧 ／mlの イ ンス リ ン 共 存下 で24時間 の 培 養によ り有意 に増加し た。し かし、 同様の 刺激に より、 培養液 中のMIF蛋 白量は 減 少 し てい た 。 こ のこ と は ブ ドウ 糖 ・ イ ンス リ ン 刺 激はMIFmRNA発 現 の みな ら ず 、MlF蛋 白 の 分 泌 あ る い は 細 胞 内 へ の 取 り 込 み や 分 解 を 調 節 し てい る 可 能 性が あ る と 考え ら れ る 。 次 に、3T3‐L1脂肪細 胞を、 ブドウ 糖・イ ンスル ンとと もに、ブドウ糖輸送を阻害する作用を
持っているサイトカラシンB (20 VM)を培養液に加えて刺激した。その結果、24時間後の培養 液中のMIF蛋白は増加していた。サイトカラシンBの他の作用による影響は否定できないが、
細胞内へのブドウ糖輸送がMIF分泌の調節に重要であることを示唆する結果と考えられる。
更に、3T3‑L1脂肪細胞を抗糖尿病薬であるピオグリタゾン（5VM)を加えて24時間刺激し たところ、培養液中のMIF蛋白量は有意に増加した。ピオグルタゾンは脂肪細胞の分化を促進 し、インスリン抵抗性を改善する薬剤である。インスリン抵抗性状態にある脂肪細胞に対して は、ピオグリタゾンはブドウ糖の細胞内への輸送を促進させるが、通常の3T3‑L1脂肪細胞に対 しては、ピオグルタゾン単独では細胞内へのブドウ糖輸送は亢進させないことが以前示されて いる。したがって、この培養液中MIF増加という結果は細胞内へのブドウ糖輸送とは別の機序 によるものであると考えられる。ピオグリタゾンの作用を考えると、脂肪細胞の分化促進がー つの候補に挙げられる。
このようなin vitroにおける脂肪細胞のMIF発現・分泌とNIDDMの病態との関連を調べるた め、OLETFラット、Wistar fattyラッ卜の副睾丸周囲脂肪組織におけるMIF mRNAの発現を検 討したところ、それぞれの対照ラットと比較して明らかに減弱していた。肥満・糖尿病モデル ラットでは高血糖を呈していたにもかかわらず、このような結果が得られたことは、in vitroに おけるブドウ糖によるMIF mRNA発現増強という結果と一見合致しないように思われる。しか し、NIDDMの病態は脂肪細胞を含む末梢組織のインスルン抵抗性と膵6細胞のインスリン分泌不 全が相まって生じるインスリン作用不足であることを考えると、糖尿病ラットの脂肪細胞にお けるインスルン作用も減少しているはずである。したがって高血糖状態であっても細胞内への ブドウ糖輸送が十分ではないため、糖尿病ラットの脂肪組織におけるMIF mRNA発現が減弱し ていたと考えられる。
血漿中のMIF濃度は、肥満・糖尿病ラットと対照ラットの聞に有意な差はみられなかったが、
OLETFラットでやや増加している傾向がみられた。インスリン作用不足状態における脂肪細胞
のmRNA減少と、細胞外MIF蛋白増加はin vitroの結果と一致する。
Wistar fattyラットの血清中のMIFは、ピオグリタゾン投与により有意に増加した。ビオグリ タゾン投与によルインスリン抵抗性が改善され、高血糖の改善がみられたが、血中のMIFは増 加していた。この結果は、脂肪細胞のMIF mRNA発現がブドウ糖、インスリンのみによって規 定されないことを示している。in vitroの結果と同様に脂肪細胞の分化を含めた他の要因が考え られるが、現時点ではその理由は不明である。
脂肪細胞におけるMIFの分泌は、膵B細胞ヘ作用することによルインスリン分泌を制御してい る可能性がある。糖尿病状態で、脂肪細胞からのMIF分泌が増加するということは、インスリ ン分泌を代償性に刺激するメディェーターになっている可能性がある。さらに脂肪組織局所に おいても何らかの作用を及ぼしている可能性もある。MIFの糖代謝に対する作用についてのさら なる研究により、糖尿病の病態生理の解明に新たな展開がもたらされるものと期待される。
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学 位 論 文 審 査 の 要旨
学位論文題名
Regulation of Ix/Iacrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) Expression by Glucose and Insulin in Adipocytes In Vitro
（脂肪細胞におけるブドウ糖とインスリンによる マ クロ フ ァー ジ 遊 走阻 止 因子発 現の制御）
マクロファージ遊走阻止因子(macrophage mlgrationinhibitoryfactor；MIRは、日萃p細胞からの イ ンス リン 分 泌に 重要 な役 割 を果 たす 。ま た、 脂肪細胞はインスリン 非依存型糖尿病（non． insulin−dependentdiabetesme｜‖tus；NlDDM）の病態に大いに関与しているが、MIFの発現が脂 肪細胞で も以前示された。そこで申 請者は、脂肪細胞におけるMlF発現の制御機構を検討した 。 方法と しては、培養脂肪細胞であ る3T3‐L1を、種々の濃度の ブドウ糖・インスリンなどの 存 在 下 で 培 養 し 、MlFmRNAの 発 現 とMIF蛋 白の 産生 を それ ぞれNonhembIot法、enzyme−Iinked immunosorbentassay（ELlSA） 法に より 評価 した 。 肥満 ・糖 尿病 モデ ル ラッ トで あるOtsuka Long‐EvansTokushimaFa叫（OLETF）ラッ ト、Wistarfattyラットの副 睾丸周囲脂肪組織におけ る MlFmRNAの 発 現 をNonhemblot法 で 、 血 漿 中 のMIF量 をELlSA法 で 評 価 し た 。 3T3−L1脂肪 細胞 を ブド ウ糖 ・イ ンス リ ンに より それ ぞ れ単 独で 刺激 した際には、MlFmRNA 発現は変 化しなかった。しかし、ブ ドウ糖とインスリン共存下で は、MIFmRNA発現が増強した 。 こ の反 応は 刺 激8時 間 以降で認められた。 これらの結果により、3T3・L1脂肪細胞においては、
細 胞 内 へ の ブ ド ウ 糖 の 輸 送 がMlFmRNA発 現 の 制 御 に 重 要な 因子 であ る こと が推 測さ れ る。
細 胞 内MlF蛋 白 量 は 、mRNAと 同様 に400mg/dIのブ ドウ 糖 ．5ug／mlの イン スリ ン共 存 下で の 培養 によ り 有意 に増 加し た 。し かし 、同 様の 刺激により、培養液中 のMIF蛋白量は減少して い た。 更に 、 ブド ウ糖 ・インスリンととも に、細胞内へのブドウ糖輸 送阻害作用を持っサイト カ ラシ ンB（20uM） を 培養 液に 加え た結 果 、培 養液 中のMlF蛋白 は増 加 した。これらのことは ブ ドウ 糖・ イ ンス リン 刺激 はMlFmRNA発 現 のみ なら ず、MlF蛋白 の分 泌 や細胞内への取り込み や分解を 調節している可能性を示唆 している。
次に 、3T3・L1脂 肪 細胞 を抗 糖尿 病薬 で ある ピオ グリ タ ゾン （5uM） を加えて24時間刺激し た とこ ろ、 培 養液 中のMlFは有意に増加し た。この結果は、MtF分泌量 が細胞内へのブドウ糖輸 送だけで は制御されないことを示し ている。
OLETFラ ッ ト 、Wstarfattyラ ッ ト の 副 睾 丸 周 囲 脂 肪 組 織 のMIFmRNAの 発 現 は 、そ れ ぞれ の 対照 ラッ ト と比 較し て明 ら かに 減弱 して いた 。これは、NIDDMにお いてみられるインスリン 作 用 不 足 の た め 、 脂 肪 細 胞 内 へ の ブ ド ウ 糖 輸 送 が 減 少 し て い た た め と 考 え ら れ る 。 血漿中 のMlF濃度は、肥満・糖尿病 ラットと対照ラットの間に 有意な差はみられなかったが 、
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雄
紀 和
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知 義
橋 川
上
石 皆
川
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
〇LETFラッ トでやや増加している傾向 がみられた。インスリン作用 不足状態における脂肪細胞 のmRNA減少と、細胞外MIF蛋白 増加はin vitroの結果と一 致する。
Wistar fattyラットへのピ オグリタゾン投与により高血 糖の改善がみられたが、血清中のMIF は 有意に増加した。この結果 は、in vitroの結果と同様に 脂肪細胞のMIF分泌が細胞内へのブド ウ 糖 輸送の みによって規定されないこ とを示しており、その機序は 不明であるが、脂肪細胞の 分 化を含めた他の要因が考え られる。
脂 肪細 胞に おけ るMIFの 発現 ・ 分泌 は、 膵B細胞 さら に脂肪組織 局所においても何らかの作 用 を 及ぼし ている可能性があり、さら なる研究により、糖尿病の病 態生理の解明に新たな展開 が もたらされるものと期待さ れる。
審 査にあ たり、副査皆川教授より、1）MIFに着目した理由につい て、2）糖尿病におけるMIF 以 外のfactorの関与について 、3）in vivoでの抗MIF抗体の効果にっいて、4）MIFが糖尿病発症に ど のように関与しているのか 、5） MIFが治療の指標になりうるかについて質問があり、副査川上 教 授 より1）使用したモデルラットの妥 当性について、2）ピオグリ タゾンに代わる薬剤につい て の質問があった。主査石橋 教授からは、1）3T3‑L1の特徴について、2）glucoseとinsulinによ るMIF mRNAの 上昇 の意 義 につ いて 、3）細 胞内 と細 胞 外MIF量の 和 につ いて 、4）MIFのmRNA と 蛋白のどちらが先に増加す るのかについての質問があっ た。フ口アからはin vivoでインスリ ン を 投与 した 際のMIFにつ いて の質問 があった。申請者はこれらの 質問に対して適切な解答を お こなった。
審 査員 一同 は本 研 究を 、脂 肪細胞に おけるMIF発現の制御機構に ついて検討した研究として 高 く 評 価 し 、 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る と 判 定 し た 。
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