博 士 （ 農 学 ） 曽 根 輝 雄
学 位 論 文 題 名
い も ち 病 菌 の 日 本 菌 系 に お け る 遺伝 子 解 析 系の 確 立 お よ び 病 原 性 レー ス 変 異 機構 解 析 へ の応 用
学 位 論 文 内 容 の 要旨
いも ち病はイ ネの全て の栽培地 域に見ら れる最重 要病害である。いもち病はその病原 子 の う菌 い も ち病 菌(Magnaporthe grisea)がイ ネに寄生 すること によって起 こり，特 に穂 首に発生 した場合 には白穂 となり， 著しい減 収をもたら す。本病害の防除の為に，
いも ち病抵抗 性のイネ の育種が 試みられ ，効果が 見られてい るが，それは恒久的なもの では なく，新 たな病原 性を獲得 した病原 菌により ，しばしば 抵抗性の崩壊が報告されて いる 。いもち 病菌のイ ネ品種に 対する宿 主特異性 は，病原性 レースで表されており，こ の病 原菌にお ける病原 性の獲得 は新レー スの出現 として表現 できる。その原因として病 原性 レースの 変異が挙 げられて いるが， その変異 の発生機構 についてはほとんど解明さ れて いない。
その 解明のた めに，日 本のいも ち病菌は 研究材料 として適している。まず，日本のい もち 病菌病原 性レース 判別体系 はイネの いもち病 抵抗性遺伝 子に対応しており，イネの いも ち病抵抗 性に関す る研究の 蓄積があ る。この 体系に即し た研究を行うことにより，
その 研究の蓄 積を活用 すること ができる 。さらに ，日本では 圃場における抵抗性遺伝子 の導 入及ぴそ の崩壊が 報告され ており， 圃場での 抵抗性の崩 壊に直接関連した研究材料 であ る。また 日本は地 理的に隔 離された 農業環境 にあり，い もち病菌が独自の進化をた どっ たことが 期待でき るからで ある。
そこで，本論文では日本のい、もち病菌を用いた病原性レース変異機構の解明の為の遺 伝 子 解 析 系 の 確 立 を 試 み た 。 内 容 の 要 約 は 以 下 の 通 り で あ る 。 ・
1．いもち病菌の交配実験系の確立
Florの遺伝子 対遺伝子 説によると ，病原性 レースは，非病原性遺伝子によって支配さ れている 。その様 な産物が未 知の遺伝 子の解析 には，交配実験系が不可欠である。当研 究室保存 の日本産 イネいもち 病菌の中 から雌性 機能のあ るイネい もち病菌Guyllと交配 可能 で ある 菌 株 を検 索 し た。 そ の結 果 ，Ina168と の交配(cross2107)で ，36株の交 配 後代を得 ることが できた。次 にこの交 配を使っ てカスガマイシン耐性遺伝子をモデルと した 遺 伝解 析 を 行っ たと ころ，カ スガマイシ ン耐性はcross2107で1ニ1に分 離し，1つ の遺伝子ksrヱによって支配されてしゝることがわかった。Bulked Segregant Analysisによ り 得 た2つ のksr‑ユ に 密 接 に 連鎖 し たRAPDマ ー カ ーOPA‑11，OPG‑06の 解析 の 結果 ， RFLPマー カ ーの 分 離 比から， この交配 が地図作成 には不適 当である ことが示 された。
cross2107交配 後 代2107‑33のGuyllへ の 戻し 交 配cross5307から は ，65株 の 後代 が得
られ，遺伝子解析に適当であったので，ksr・iの遺伝子地図を作成した。ksr‑ヱは，OPG‑
06
，OPA‑11
か らそ れぞ れ8.1，23.8セ ンチ モル ガン の距 離で あっ た。 これに より ，日 本 判 別菌 系の1
つで あるIna168
を 使っ て， 稔性 は低 いが 遺伝 子解 析可 能な交 配系 が得 られたことが示された。2.
いもち病菌圃場分離株の解析DNA
フ イン ガープ リン ト解 析と バル スフ イー ルド ゲル 電気 泳動 法に より， 日本 産イ ネい もち 病菌 圃場 分離 株の 特徴 付け を行 った 。まず 菌株Ina72
のゲノムDNAライブラリ ー か ら プ ロ ー ブpMG6015
を 得 た ． こ の プ ロ ー ブ はMGR586
と は 別 の 反 復配列 を含 んで い た 。7
種 の 日 本 判 別 菌 系 （1960
年 以 前 に 分 離 ） と17
株 の 圃 場 分 離 株（1980年 以降 に 分 離 ） をpMG6015
とMGR586
をDNA
フ イ ン ガ ー プ リ ン ト 解 析 のプ ロ ー ブ と し て 解 析 し た 。UPGMA
法 に よ り 作 成 し た 系 統 樹の ブート スト ラッ プ解 析に より ，2種 のプ 口ー ブ に よるDNA
フイン ガー プリ ント に基 づく 系統 樹が ，い もち 病菌 系統 の判定 に適 当で あ っ た 。 解 析 の 結 果 ， すべ て の 菌 株 は5種のclonallineage (JBLA‑INA，JBLA‑K04，JBLB‑K33
，JBLB‑HK1， 、JBLC‑P2B)に 分け られ た。 こと に，JBLA‑K04
には， すべ ての 圃場 分離 株が 属し てお り，1960
年か ら1980年 にかけ て，clonal lineage
の単純化およ び，clonal lineage
内での病原性レースの多様化が起こったことが示唆された。これと い も ち 病 抵 抗 性 イ ネ 品 種 の 導 入 ・ 抵 抗 性 の 崩 壊 と の 関 係 に 興 味 が も た れ る 。パ ルス フイ ール ドゲ ル電 気泳 動に よる 核型 解析に より ，い もち病菌の核型がclonal
lineage
内で も多 様であ り， レー スの菌株ごとに共通性があることが示された。これに より，clonal lineage内でのレース分化に，染色体長の変化・（再編成）が関与している 可能性が示された。3. RFLP
プローブpMG6015の塩基配列解析pMG6015
と 同 様 の 配 列 を 持 つ ク ロ ー ン を ， イ ネ い もち 病 菌Ina72
の スEMBL3ラ イブ ラリ ーよルスクリーニングし，解析したところ，この反復配列の中´い的配列であると 思 わ れ る0.7 kb
の 反 復 配列 が 発 見 さ れ，MGSR1
とし た。MGSR1
の 塩基 配列を 決定 した と こ ろ ．RNA
ポ リ メ ラ ー ゼIII
プ ロ モ ータ ーを 持っ レト ロポ ゾン の特 徴を示 した 。ま た ． パル スフ イー ルド ゲル のサ ザン ブロ ット解 析に より ，MGSR1は全 ての染 色体 上に 存在 して いる こと が示 され た。 これ らレ トロ ポゾン 等の 転移 因子は，レース変異の原 因で ある いも ち病 菌の 遺伝 子の 不安 定性 ある いは易 変異 性， ゲノムの多様性に関与し ていることが期待される。4.
イネいもち病菌Ina168の染色体長変異の解析イ ネい もち 病菌
Ina168
の 保存 菌株 中に ，染 色体長 変異 株を 発見した。パルスフイー ル ド ゲ ル 電 気 泳 動 に よ る解 析 に お い て， 変異 株は 親株 より も1本 多い7
本の バン ドか らな る核 型を 示し た。 親株 の核 型を ， 変異 株の核 型を とし，変異株に現れた新 た な 約5Mb
の 長 さ の 染 色 体 をv
染 色 体 と し た 。 こ の 変 異 はDNA
フ イ ン ガープ リン トの パタ ーン や品 種特 異的 病原 性， 交配 能に 影響 を与え なか った 。一連の単胞子分離実験 に よ り ， こ の 変 異 が1
回 の 単 胞 子 分 離に おいて12.5
％の 高頻 度でd
→ の 方向 にし か 起 こら ない こと が示 され た。 サザ ンブ ロット 及び2
次 元ゲ ル電 気泳 動解析 によ り，V
染 色体 は核 型aの バン ドIIIbの 一部 が欠 失す ること によ り生 じたことが示唆された。また ，rDNAが この 染色 体再 編成 に関 与し てい る可能 性が 示さ れた。いもち病菌におい て， この よう な染 色体 長変 異が 直接 観察 され たのは 初め てで あり，いもち病菌の染色 体再編成の機構の解明への応用に期待がもたれる。
以 上の 結果 は， 日本 産イ ネい もち 病菌 の遺 伝子解 析系 を確 立したのみならず，その
病原性レース変異機構解明への応用の指針を与えている。今回確立された実験系によ
り多くの新たな知見が得られ，いもち病菌の遺伝子変異機構にもとづく新たな防除法
の確立に寄与することが期待される。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
しゝもち病菌の日本菌系における遺伝子解析系の確立 および病原性レース変異機構解析への応用
本 論文 は 和 文122頁 ，図33，表24，引 用 文献64，緒 論，和文 および英 文総括から なり，ほかに参考論文17編が付されている。
い も ち 病は 子 の う菌 いも ち病菌(Magnaporthe grisea)が イネに寄 生するこ とによっ て起こ るイネの 最重要病 害である 。本病害 の防除の 為に，いもち病抵抗性のイネの育種 が試み られ，効 果が見ら れている が，新た な病原性 を獲得した病原菌による抵抗性の崩 壊が問 題となっ ている。 いもち病 菌のイネ 品種に対 する宿主特異性は，病原性レースで 表 され て お り， こ の病 原 菌におけ る病原性 の獲得は 新レース の出現とし て表現で きる が，そ の原因の 病原性レ ースの変 異の発生 機構につ いてはほとんど解明されていない。
その様 な背景の 中で，本 研究は日 本のいも ち病菌を用いた病原性レース変異機構の解 明の為の遺伝子解析系の確立を試みたものである．
第1章 ， 緒 論で は ぃも ち 病 菌遺 伝 子 の研 究 史， 研 究 目的につ いて述べら れている 。 第2章， いもち病 菌の交配 実験系の 確立につ いて述べ られ，下記 の内容が 含まれてい る。
1． 当 研究 室 保 存の 日 本産 イネいも ち病菌の 中から交 配可能で ある菌株を 検索し，2つ の交配cross2107及びcross5307を得た。
2．上記 の交配を 使ってカ スガマイ シン耐性 遺伝子を モデルとし た遺伝解 析を行い，カ スガマイシン耐性遺伝子ksr‑ヱを定めた。
3．RAPDマ ーカ ーOPA‑11，OPG‑06及 ぴRFLPマ ーカ ー の解 析 よ り，ksr ‑ヱ の 遺伝 子 地 図を作成し，この交配の有用性を示した。 ．
第3章 ， い もち 病 菌圃 場 分 離株 の 解 析で は ，DNAフ イ ンガ ー プリ ン ト 解析 と パル ス フイー ルドゲル 電気泳動 法による 解析につ いて述べ られ，下記の内容が含まれている，
1． 菌 株 Ina72の ゲ ノ ム DNAラ イ ブ ラ リ ー か ら プ ロ ー ブ pMG6015を 得 た 。 2．7種 の 日 本 判 別 菌 系 と17株 の 圃 場 分 離 株 をpMG6015とMGR586をDNAフ イ ン ガ ー プ リ ン ト 解 析 の プ ロ ー ブ と し て 解 析 し ，pMG6015が 有 用 で あ るこ と ，5種 のclonal lineage (JBLA‑INA，JBLA‑K04，JBLB‑K33，JBLB‑HK1，JBLC‑P2B)の 存在 を 示し た 。 さらに，1960年から1980年にかけて，clonal lineageの単純化およぴ，clonal lineage内
男
哲
郎
房
一
田
藤
田
冨 内
上
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
で の 病 原 性 レ ー ス の 多 様 化 が 起 こ っ た こ と を 明 ら か に し た 。
3． パ ル ス フ イ ー ル ド ゲ ル 電 気 泳 動 に よ る 核 型 解 析 に よ り ， い も ち 病 菌 の 核 型 がclonal lineage内 で も 多 様 で あ り ， レ ー ス の 菌 株 ご と に 共 通 性 が あ る こ と を 示 し た 。 第 4章 ，RFLPプ ロ ー ブpMG6015の 塩 基 配 列 解 析 で は ，MGSR1と ぃ う ト ラ ン ス ポ ゾ ン 様 因 子 の 発 見 に つ い て 述 べ ら れ ， 下 記 の 内 容 が 含 ま れ て い る 。 1．pMG6015と 同 様 の 配 列 を 持 つ スEMBL3ラ イ ブ ラ リ ー の ク ロ ー ン を 解 析 し ， こ の 反 復 配 列 の 中 心 的 反 復 配 列 で あ るMGSR1が 発 見 さ れ た 。
2．MGSR1の 塩 基 配 列 を 決 定 し た と こ ろ レ ト ロ ポ ゾ ン の 特 徴 を 示 し た ． ま た ，MGSR1 は 全 て の 染 色 体 上 に 存 在 し て い る こ と が 示 さ れ た 。
第5章 ， イ ネ い も ち 病 菌Ina168の 染 色 体 長 変 異 の 解 析 で は ， 染 色 体 長 変 異 の 基 本 的 な 特 徴 に つ い て 述 べ ら れ て お り ， 下 記 の 内 容 が 含 ま れ て い る 。 1． イ ネ ぃ も ち 病 菌Ina168の 保 存 菌 株 中 に ， 染 色 体 長 変 異 株 を 発 見 し ， 親 株 の 核 型 を
， 変 異 株 の 核 型 をd と し ， 変 異 株 に 現 れ た 新 た な 約5Mbの 長 さ の 染 色 体 をy染 色 体 と し た 。
2． 一 連 の 単 胞 子 分 離 実 験 に よ り ， こ の 変 異 が1回 の 単 胞 子 分 離 に お い て12.5％ の 高 頻 度 でa‑ロ の 方 向 に し か 起 こ ら な い こ と が 示 さ れ た 。
3． サ ザ ン ブ 口 ッ ト 及 ぴ2次 元 ゲ ル 電 気 泳 動 解 析 に よ り ，y染 色 体 は 核 型aの バ ン ド IIIbの 一 部 が 欠 失 す る こ と に よ り 生 じ た こ と ， 及 びrDNAが こ の 染 色 体 再 編 成 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
よって．
根輝雄
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