酵素触媒によるジウレタンジオール (x,y) とジエチルカーボネートの重

4.3 実験方法 117

パーゼCA 17.7 mg (30 wt%)をはかり取り、常温で6時間減圧乾燥した。次いでマイクロシ リンジを用いてジエチルカーボネート61 µL (59.5 mg; 0.50 mmol)及びアニソール 0.3 mL を添加した。昇温デシケーターを用いて150℃で4 時間減圧乾燥したモレキュラーシーブ4A を充填した小カラムを小試験管上部に取り付け、窒素雰囲気下、密栓し、110 ℃の油浴上で3 日間攪拌した。反応混合物をDMF 5 mLに110℃で溶解させ、不溶の酵素をろ紙を敷いた桐 山漏斗を用いて吸引濾別した。次いで、濾液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮後、昇 温デシケーターを用いて80 ℃で減圧乾燥することにより、粗ポリマーを得た。ジウレタンジ オール(3,6)のポリマーへの転化率は¹H NMRで1.67 ppm (HOCH₂CH₂CH₂-)と1.87 ppm (-OCOOCH₂CH₂CH₂-)のメチレン由来ピークの積分値を用いて算出した。粗ポリマーの分 子量の測定はSECを用いて行った。その結果、ジウレタンジオールの転化率 98%でM_w = 20,000 (M_w/M_n = 2.2)の粗ポリマーが得られたことを確認した。また、粗ポリマーの末端構 造の解析はMALDI-TOF MSを用いて行った。

粗生成物をDMF 0.5 mLに110℃で溶解し、これを磁気撹拌子を付した50 mLナスフラス コ内のメタノール 30 mL中に攪拌しながら徐々に滴下し、再沈殿による精製を行い、精製ポ リマーを133.1 mg (90 %)得た。SECを用いた分子量測定の結果、精製ポリマーの分子量は、

M_w = 20,000 (M_w/M_n = 2.0)であった。精製ポリマーの¹H NMR及び¹³C NMRをFig.

4.5及びFig. 4.6にそれぞれ示す。

(2) MALDI-TOF MS測定用試料溶液の調製

(ポリマー試料) 

ポリマー溶液10µL、マトリックス溶液90 µL及びイオン化助剤溶液10µL を0.5 mLマイ クロテストチューブにはかり取り、テストチューブミキサーを用いて攪拌してポリマー試料溶 液を調製し、この1µLをMALDI-TOF MS測定用ターゲットに塗布して測定した。ポリマー 溶液、マトリックス溶液及びイオン化助剤溶液の調製法を以下に記す。

ポリマー溶液  

乾燥後のポリマー 1 mgを1.5 mLマイクロテストチューブにはかり取り、DMF 200 µLを加えて溶解し、ポリマー試料のDMF溶液(5 mg/mL)を調製した。ポリマーが溶 解しづらい場合は、ウォーターバスを用いて約50℃に加温して溶解した。

マトリックス溶液  

2-(4-hydroxyphenylazo)-benzoic acid (HABA) 10 mgを1.5 mLマイクロテストチュー ブにはかり取り、クロロホルム/メタノール = 9/1 (v/v)混合溶媒 1 mLを加えて溶解 し、マトリックス溶液 (10 mg/mL)を調製した。

イオン化助剤溶液  

臭化ナトリウム1 mgを1.5 mLマイクロテストチューブにはかり取り、メタノール 400 µLを加えて溶解後、クロロホルム600µLを加えてイオン化助剤溶液(1 mg/mL)を調

4.3 実験方法 119 製した。

(検量線用試料)

検量線用標準試料にはPeptide calibration standard (1000-4000 Da) (Bruker Daltonics Inc.)を用いた。ペプチド溶液 2 µL及びマトリックス溶液 6 µLを0.5 mLマイクロテスト チューブにはかり取り、テストチューブミキサーを用いて攪拌してペプチド試料溶液を調製し、

この1 µLをMALDI-TOF MS測定用ターゲットに塗布して測定した。Peptide Calibration Standardに含まれるペプチドをTable 4.4に示す。また、ポリマー溶液及びマトリックス溶液 の調製法を以下に記す。

Table 4.4: Peptide calibration standard (1000-4000 Da).

Substance Mono isotopic Average [M+H]⁺ [M+H]⁺ Angiotensin 1046.54 1047.20 Angiotensin 1296.69 1297.51 Substance P 1347.74 1348.66

Bombesin 1619.82 1620.88

ACTH clip 1-17 2093.09 2094.46 ACTH clip 18-39 2465.20 2466.73 Somatostatin 28 3147.47 3149.61

ペプチド溶液  

Peptide caribration standard (1000-4000 Da)の入った容器に0.1%トリフルオロ酢酸 水溶液125µLを加えて溶解し、各ペプチドの濃度が4 pmol/µLになるようにペプチド 溶液を調製した。

マトリックス溶液  

α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid 5 mgを1.5 mLマイクロテストチューブにはかり 取り、アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸水溶液 = 1/2 (v/v)混合溶媒 1 mL を加え、テストチューブミキサー及び超音波をあててα-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid を懸濁させた。その後、小型微量遠心機を用いて懸濁物を沈殿させることで α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid 飽和溶液を得、これをマトリックス溶液として調製 した。

(3)熱分析

得られたPCU (x,y)の熱特性の解析はDSCを用いて行った。

PCU (x,y) 4-5 mgをシールセルにはかり取り、シーラーを用いてセルを密閉した。基準物

質用のセルはからのまま密閉した。Table 4.5に示すタイムプログラムで測定を行った。

Table 4.5: Time program of DSC measurements of PCU (x,y).

Heating/Cooling Temperature range Heating/Cooling rate

(℃) (℃/min)

First heating -50〜180 10

Cooling 180〜 -50 -50

Second heating -50〜180 10

4.3 実験方法 121

3 2 1 0

7

8 6 5 4 ppm

TMS DMSO

HOD

PCU (3,6)

CO(CH2)3OCNH(CH2)6NHCO(CH2)3O n

O O O

Fig. 4.5: 300 MHz¹H NMR spectrum of PCU(3,6) in DMSO-d₆.

50 0

200 150 100 ppm

DMSO

Fig. 4.6: 75 MHz ¹³C NMR spectrum of PCU(3,6) in DMSO-d₆.

PCU(3,6): ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 1.22 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂ -), 1.36 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.87 (quintet, 4H, -OCOCH₂CH₂CH₂-, J = 6.2 Hz), 2.93 (td, 4H, -NHCH₂CH₂-, J = 6.0 Hz), 3.98 (t, 4H, -NHCOOCH₂CH₂-, J = 6.2 Hz), 4.11 (t, 4H, -OCOOCH₂CH₂-, J = 6.2 Hz), 6.62-7.34 (br, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 25.9 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 28.1 (-OCOOCH₂CH₂CH₂ -), 29.4 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 40.1 (-NHCH₂CH₂-), 60.1 (-NHCOOCH₂CH₂-), 64.5 (-OCOOCH₂CH₂ -), 154.5 (-OCOO--), 156.1 (-NHCOO-).

PCU (x,y)の¹H NMR及び¹³C NMRの結果を以下に示す。

PCU(3,4): ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 1.35 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂CH₂ -), 1.87 (quintet, 4H, -OCOCH₂CH₂CH₂-, J = 6.0 Hz), 2.93 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 3.98 (t, 4H, -NHCOOCH₂CH₂-, J = 6.0 Hz), 4.12 (t, 4H, -OCOOCH₂CH₂-, J = 6.0 Hz), 6.70-7.21 (br, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 26.8 (-NHCH₂CH₂CH₂CH₂-), 28.1 (-OCOOCH₂CH₂CH₂ -), 39.9 (-NHCH₂CH₂-), 60.2 (-NHCOOCH₂CH₂-), 64.5 (-OCOOCH₂CH₂-), 154.5

(-OCOO-), 156.2 (-NHCOO-).

PCU(3,5): ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 1.22 (quintet, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂CH₂ -, J = 6.6 Hz), 1.37 (quintet, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-, J = 6.6 Hz), 1.87 (quintet, 4H,

-OCOCH₂CH₂CH₂-, J = 6.0 Hz), 2.93 (td, 4H, -NHCH₂CH₂-, J = 6.6 Hz), 3.98 (t, 4H, -NHCOOCH₂CH₂-, J = 6.0 Hz), 4.11 (t, 4H, -OCOOCH₂CH₂-, J = 6.0 Hz), 6.70-7.21 (br, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.5 (-NHCH₂CH₂CH₂CH₂-), 28.1 (-OCOOCH₂CH₂CH₂ -), 29.0 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 40.1 (-NHCH₂CH₂-), 60.1 (-NHCOOCH₂CH₂-), 64.5 (-OCOOCH₂CH₂ -), 154.5 (-OCOO--), 156.1 (-NHCOO-).

4.3 実験方法 123