環状エステル‐ウレタン (x,y,z) モノマーの合成

Diurethanediol (x,y) (x=2, 3, y=2-6)

HO(CH2)xOCNH(CH2)yNHCO(CH2)xOH

O O

C₂H₅OH Lipase CA

+ H5C2OC(CH2)zCOC2H5

O O

Dicarboxylate ester (z = 1 - 4)

Cyclic(ester-urethane) oligomer (x,y,z) (x = 2, 3, y = 2 - 6, z = 1 - 4)

m

C(CH₂)_zCO(CH₂)_xOCNH(CH₂)_yNHCO(CH₂)_xO O

O O O

Scheme 5.4: Enzymatic preparation of cyclic ester-urethane (x,y,z) monomer by the reaction of diurethanediol (x,y) and dicarboxylate ester.

酵素触媒を用いたジウレタンジオール(x,y) (x=2, 3, y=2-6)とマロン酸ジエチル(z=1)、コ ハク酸ジエチル (z=2)、グルタル酸ジエチル (z=3)又はアジピン酸ジエチル (z=4)との縮合 による環化反応は、縮合により生成するエタノールの吸収剤としてモレキュラーシーブ4Aを 充填した小カラムを上部に取り付けた30 mLナスフラスコを用いて有機溶媒中、110℃、1日 間攪拌することにより行った。Fig. 5.3に反応容器の模式図を示した。

一例として、環状エステル‐ウレタン(2,6,4)モノマーの合成法を以下に記す。

撹拌子を付した30 mLナスフラスコに、ジウレタンジオール(2,6) 146.2 mg (0.5 mmol)及 びリパーゼCA 203 mg (200 wt% relative to diethyl adipate)をはかり取り、常温で6時間 減圧乾燥した。次いでマイクロシリンジを用いてアジピン酸ジエチル100 µL (101.3 mg; 0.5 mmol)及びアニソール 25 mLを添加した。昇温デシケーターを用いて150℃で4時間減圧乾 燥したモレキュラーシーブ4Aを充填した小カラムを30 mLナス型フラスコに取り付け、窒素 雰囲気下、密栓し、110℃の油浴上で1 日間攪拌した。反応混合物をろ紙を敷いた桐山漏斗を 用いて吸引濾別し、不溶の酵素を濾別した。濾液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮後、

昇温デシケーターを用いて80 ℃で減圧乾燥することにより、粗生成物を得た。粗生成物の分 子量及び分子構造の解析をSEC、MALDI-TOF MS及び¹H NMRを用いて行った。その結 果、粗生成物は環状1量体を主生成物とする分散の小さいオリゴマー(M_w = 400、M_w/M_n = 1.5)であることを確認した。

次いで、分解生成物の主成分である環状エステル‐ウレタン (2,6,4)モノマーの精製を以下 のように行った。分解生成物をクロロホルム1 mLに溶解させ、クロロホルム/酢酸エチル = 1/3 (v/v)を展開溶媒に用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Silica Gel 60N 30 g)で Rf = 0.46のフラクションを分取することで、環状エステル‐ウレタン(2,6,4)モノマーを217

5.3 実験方法 187

110 ^oC Molecular sieves 4A

Fig. 5.3: The reaction vessel of the enzymatic preparation of cyclic ester-urethane (x,y,z) monomer.

mg (収率 54 %)得た。精製した環状エステル‐ウレタン (2,6,4)モノマーの¹H NMR及び

13C NMRをそれぞれFig. 5.4及びFig. 5.5に示す。また、元素分析の結果も併せて示す。

(2) MALDI-TOF MS測定用試料溶液の調製

(分解生成物及び環状モノマー) 

分解生成物溶液 10 µLをマイクロテストチューブにはかり取り、そこへイオン化助剤溶 液 10 µ及びクロロホルム/メタノール= 9/1 (v/v)混合溶媒 90µLを加え、テストチューブ ミキサーを用いて攪拌することで分解生成物溶液の希釈液を得た。マトリックス溶液 1 µを

MALDI-TOF MS測定用ターゲットに塗布した後、その上から分解生成物溶液の希釈液 1µL

を重ねて塗布して測定を行った。環状モノマーの場合も同様にして行った。分解生成物溶液、

環状モノマー溶液及びマトリックス溶液の調製法を以下に記す。イオン化助剤溶液の調製は第

4.3.2節に記した方法と同様にして行った。

分解生成物溶液及び環状モノマー溶液  

乾燥後の分解生成物1 mgを1.5 mLマイクロテストチューブにはかり取り、クロロホル ム/DMF = 3/1 (v/v)混合溶媒200µLを加えて溶解し、分解生成物溶液 (5 mg/mL) を調製した。環状モノマーの場合は溶媒にクロロホルムを用い、その他は分解生成物溶 液の調製と同様に行った。

マトリックス溶液  

コバルト 1 mgを1.5 mLマイクロテストチューブにはかり取り、エタノール 1 mLを 加え、テストチューブミキサー及び超音波をあててコバルトを懸濁させた。これをマト リックス溶液として調製した。

(検量線用試料)

検量線用試料にはPeptide caribration standard (1000-4000 Da)を用い、溶液の調製は第

4.3.2節に記した方法と同様にして行った。

5.3 実験方法 189

3 2 1 0

7

8 6 5 4 ppm

DMSO TMS HOD

Cyclic(ester-urethane) (2,6,4) monomer C(CH2)4CO(CH2)2OCNH(CH2)6NHCO(CHm2)2O

O

O O O

Fig. 5.4: 300 MHz¹H NMR spectrum of cyclic ester-urethane (2,6,4) monomer in DMSO-d₆.

50 0

200 150 100 ppm

DMSO

Fig. 5.5: 75 MHz¹³C NMR spectrum of cyclic ester-urethane (2,6,4) monomer in DMSO-d₆.

Cyclic ester-urethane (2,6,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.22 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.36 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂), 1.52 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.25 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.95 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 4.18 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂-), 6.82-7.23 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.8 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 25.8 (-NHCH₂CH₂CH₂ -), 29.5 (-CH₂CH₂COO-), 33.3 (-CH₂CH₂COO-), 39.9 (-NHCH₂CH₂-), 61.0 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 62.5 (-NHCOOCH₂CH₂-), 156.1 (-NHCOO-), 172.4 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₈H₃₀N₂O₈ (402.4): Calcd. C 53.72, H 7.51, N 6.96; Found C 53.80, H 7.50, N 6.92

環状エステル‐ウレタン(x,y,z)モノマーの¹H NMR、¹³C NMR及び元素分析の結果を以 下に示す。

Cyclic ester-urethane (2,2,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.55 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.31 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 3.07 (m, 4H, -NHCH₂CH₂ -), 4.06-4.34 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂-), 6.70-7.12 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.8 (-CH₂CH₂COO-), 33.2 (-CH₂CH₂ COO-), 40.1 (-NHCH₂CH₂-), 62.0 (-NHCOOCH₂CH₂-), 62.4 (-NHCOOCH₂CH₂-), 155.9 (-NHCOO-), 172.8 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₄H₂₂N₂O₈ (346.3): Calcd. C 48.55, H 6.40, N 8.09; Found C 48.57, H 6.36, N 8.04.

Cyclic ester-urethane (2,3,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.42-1.63 (m, 6H, -NHCH₂CH₂CH₂-, -CH₂CH₂COO-), 2.24 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.95 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 4.07-4.34 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂-), 6.78-7.25 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.7 (-CH₂CH₂COO-), 30.0 (-NHCH₂CH₂CH₂ -), 33.2 (-CH₂CH₂COO-), 37.9 (-NHCH₂CH₂-), 60.9 (-NHCOOCH₂CH₂-), 62.6 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 156.2 (-NHCOO--), 172.5 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₅H₂₄N₂O₈ (360.4): Calcd. C 49.99, H 6.71, N 7.77; Found C 50.04, H 6.65, N 7.68.

Cyclic ester-urethane (2,4,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.37 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 1.53 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.27 (m, 4H, -CH₂CH₂ COO-), 2.95 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 4.18 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂), 6.787.20 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.6 (-CH₂CH₂COO-), 26.8 (-NHCH₂CH₂-), 33.0 (-CH₂CH₂COO-), 40.1 (-NHCH₂CH₂-), 61.2 (-NHCOOCH₂CH₂-), 62.3 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 156.1 (-NHCOO--), 172.6 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₆H₂₆N₂O₈ (374.4): Calcd. C 51.33, H 7.00, N 7.48; Found C 51.32, H 6.94, N 7.41.

Cyclic ester-urethane (2,5,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.24 (m, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.37 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂), 1.52 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.26 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.94 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 4.18(m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂-), 6.81-7.25 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.1 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 23.7 (-CH₂CH₂ COO-), 28.8 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 33.1 (-CH₂CH₂COO-), 40.1 (-NHCH₂CH₂-), 61.1 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 62.7 (-NHCOOCH₂CH₂-), 156.1 (-NHCOO-), 172.5 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₇H₂₈N₂O₈ (388.4): Calcd. C 52.57, H 7.27, N 7.21; Found C 52.52, H 7.23, N 7.11.

5.3 実験方法 191 Cyclic ester-urethane (2,6,1) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.24 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.38 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂), 2.95 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 3.44 (m, 4H, -OCOCH₂COO-), 4.20 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂-), 6.75-7.32 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 25.6 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 29.2 (-NHCH₂CH₂CH₂ -), 29.9 (-OOCCH₂COO-), 40.7 (-NHCH₂CH₂-), 60.7 (-NHCOOCH₂CH₂-), 63.8 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 156.2 (-NHCOO--), 166.1 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₅H₂₄N₂O₈ (360.4): Calcd. C 49.99, H 6.71, N 7.77; Found C 50.12, H 6.64, N 7.70.

Cyclic ester-urethane (2,6,2) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.23 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.37 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂), 2.52 (m, 4H, -OCOCH₂CH₂COO-), 2.95 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 4.18 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂-), 6.80-7.21 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 25.5 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 28.7 (-OCOCH₂CH₂

-), 29.2 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 40.8 (-NHCH₂CH₂-), 61.2 (-NHCOOCH₂CH₂-), 62.9 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 156.1 (-NHCOO--), 171.4 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₆H₂₆N₂O₈ (374.4): Calcd. C 51.33, H 7.00, N 7.48; Found C 51.38, H 6.93, N 7.44.

Cyclic ester-urethane (2,6,3) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.22 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.36 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂), 1.76 (m, 2H, -CH₂CH₂CH₂COO-), 2.29 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.95 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 4.19 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂-), 6.77-7.22 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 19.7 (-CH₂CH₂CH₂COO-), 25.6 (-NHCH₂CH₂CH₂ -), 29.7 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 32.6 (-CH₂CH₂COO-), 40.7 (-NHCH₂CH₂-), 61.1 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 62.6 (-NHCOOCH₂CH₂-), 156.1 (-NHCOO-), 172.2 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₇H₂₈N₂O₈ (388.4): Calcd. C 52.57, H 7.27, N 7.21; Found C 52.48, H 7.18, N 7.12.

Cyclic ester-urethane (3,2,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.54 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 1.84 (m, 4H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂) 2.29 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 3.01 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 3.92-4.17 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂-), 6.67-7.21 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.9 (-CH₂CH₂COO-), 28.0 (-NHCOOCH₂CH₂CH₂ -), 33.3 (-CH₂CH₂COO-), 40.1 (-NHCH₂CH₂-), 60.7 (-NHCOOCH₂CH₂-), 61.1 (-COOCH₂CH₂ -), 156.4 (-NHCOO--), 172.6 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₆H₂₆N₂O₈ (374.4): Calcd. C 51.33, H 7.00, N 7.48; Found C 51.35, H 7.07, N 7.42.

Cyclic ester-urethane (3,3,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.52 (m, 6H, -NHCH₂CH₂CH₂-, -CH₂CH₂COO-), 1.85 (m, 4H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂-)

2.28 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.96 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 3.92-4.16 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂ -), 6.68-7.12 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.9 (-CH₂CH₂COO-), 27.9 (-NHCOOCH₂CH₂CH₂ -), 29.9 (NHCH₂CH₂CH₂-), 33.3 (-CH₂CH₂COO-), 37.7 (-NHCH₂CH₂-), 61.0 (-NHCOOCH₂CH₂ -), 61.3 (-COOCH₂CH₂-), 156.2 (-NHCOO-), 172.7 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₇H₂₈N₂O₈ (388.4): Calcd. C 52.57, H 7.27, N 7.21; Found C 52.42, H 7.25, N 7.15.

Cyclic ester-urethane (3,4,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.35 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 1.53 (m, 2H, -CH₂CH₂COO-), 1.84 (m, 4H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂ -) 2.29 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.93 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 3.91-4.18 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂ -), 6.70-7.13 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm) = 23.9 (-CH₂CH₂COO-), 26.8 (-NHCH₂CH₂ -), 27.9 (-NHCOOCH₂CH₂CH₂-), 33.2 (-CH₂CH₂COO-), 40.0 (-NHCH₂CH₂-), 60.7 (-NHCOOCH₂CH₂-), 61.1 (-COOCH₂CH₂-), 156.2 (-NHCOO-), 172.7 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₈H₃₀N₂O₈ (402.4): Calcd. C 53.72, H 7.51, N 6.96; Found C 53.69, H 7.50, N 6.79.

Cyclic ester-urethane (3,5,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.22 (m, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.35 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂), 1.52 (m, 2H, -CH₂CH₂COO-), 1.84 (m, 4H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂-) 2.29 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.94 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 3.91-4.14 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂), 6.687.09 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.1 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 23.9 (-CH₂CH₂ COO-), 28.1 (-NHCOOCH₂CH₂CH₂-), 28.8 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 33.2 (-CH₂CH₂COO-), 40.0 (-NHCH₂CH₂-), 60.3 (-NHCOOCH₂CH₂-), 60.9 (-COOCH₂CH₂-), 156.2 (-NHCOO-), 172.6 (-CH₂COOCH₂-).

C₁₉H₃₂N₂O₈ (416.5): Calcd. C 54.80, H 7.74, N 6.73; Found C 54.49, H 7.71, N 6.59.

Cyclic ester-urethane (3,6,4) monomer: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆);δ (ppm)

= 1.22 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-), 1.36 (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂), 1.52 (m, 2H, -CH₂CH₂COO-), 1.85 (m, 4H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂-) 2.30 (m, 4H, -CH₂CH₂COO-), 2.93 (m, 4H, -NHCH₂CH₂-), 3.91-4.18 (m, 8H, -NHCOOCH₂CH₂CH₂), 6.707.11 (br, 2H, -NHCOO-).

13C NMR (75 MHz, DMSO-d₆);δ(ppm) = 23.9 (-CH₂CH₂COO-), 25.6 (-NHCH₂CH₂CH₂ -), 28.0 (-NHCOOCH₂CH₂CH₂-), 29.3 (-NHCH₂CH₂CH₂-), 33.2 (-CH₂CH₂COO-), 40.1 (-NHCH₂CH₂-), 60.5 (-NHCOOCH₂CH₂-), 61.0 (-COOCH₂CH₂-), 156.2 (-NHCOO-), 172.6 (-CH₂COOCH₂-).

5.3 実験方法 193 (C₂₀H₃₄N₂O₈)_n (430.5)_n: Calcd. C 55.80, H 7.96, N 6.51; Found C 55.82, H 7.89, N 6.38.