N- グリコシル化反応
3.4.1 反応系の設定
カルバミン酸エステルが N-ベンジルオキシ化された N-(ベンジルオキシ)カルバミン酸 エステル 116 は、ヒドロキサム酸エステル誘導体としての側面も有している(Figure 3- 12)。このため、第 2 節で得た知見を参考にして考えれば、この化合物の窒素原子も求核 性を持ち合わせていると考えられ、糖誘導体との間で行う N-グリコシル化反応の基質に なり得ると期待できる。本節では、このN-(ベンジルオキシ)カルバミン酸エステル116と 糖誘導体との間でグリコシル化反応を行って N-グリコシド結合を構築し、更なる官能基 変換を施して、グリコシルアミン誘導体の合成を試みた結果について述べる。Figure 3-12 に示す合成計画にあるように、N-グリコシル化反応により生成すると期待される化合物
R1O N H
OBn O
Carbamate
Hydroxamate
N-(Benzyloxy) Carbamate 116
SmI2 MeOH
Glycosylamine Derivative R3X
O N OBn
OR1 O R2O
O H
N OR1 O R2O
O H
R2O N
R1COO
R3
Carbamate-derived Glycosylamine
118 R2O O
X +
Glycosylation
117
117 に対して、SmI2を用いた一電子還元を行えば、ベンジルオキシ基が除去され、糖の 一位のアミノ基をカルバミン酸エステルとして保護した化合物118へと変換すること可能 である。さらにこのもののアルキルオキシ部分(COOR1)を脱保護すれば、グリコシルアミ ンが生ずるが、同一系内において求電子試剤(R3X)と反応させることでグリコシルアミン を単離することなく、N-結合型糖アミノ酸を含む種々のグリコシルアミン誘導体へと変換 することが可能である。
例えば、石渡らは、グリコシルアミンの1 位アミノ基をAlloc 基で保護したグリコシル アミン誘導体に対して、同一系内で Alloc 基の脱保護とアシル化反応を一挙に行うことで、
不安定なグリコシルアミンを単離することなく N-結合型糖アミノ酸の合成に成功してい る(Figure 3-13)94)。この知見を参考にすれば、本法は様々な種類の生物活性 N-グリコシド を効率よく合成する方法になり得るものと期待できる。
Pd(PPh3)4 PhSiH3 F
O NHFmoc Ot-Bu O
O H
N
O NHFmoc Ot-Bu O OH
HO HO
NHAc 86%
Figure 3-13. Synthesis of N-Linked Glycoamino Acid from Carbamate-derived Glycosylamine O
NHAc OH HO
HO NHAlloc
3.4.2 N-(ベンジルオキシ)カルバミン酸エステルの合成
前節の合成計画において必須となる N-(ベンジルオキシ)カルバミン酸エステル 116a は 対応するクロロギ酸エステル 119a と O-ベンジルヒドロキシルアミン 86 との縮合反応を 行って合成するという、既知の方法95)により合成できた。また、エステル置換基を変えた
116b,cも同様の方法により容易に合成が可能であった(Table 3-5)。
NHOBn
Py +
COOR yield (%) Alloc
Fmoc Cbz
99 (crude) 72 71 entry
1 2 3
RO N H
OBn O RO Cl
O
CH2Cl2
116a-c product
116a 116b 116c
Table 3-5. Synthesis of Carbamate-derived Hydroxamate 116
119a-c 86
3.4.3 N-グリコシル化反応の検討
続いて、合成した N-(ベンジルオキシ)カルバミン酸エステル 116a-c とグルコサミン由 来のグリコシルフルオリド 120 を用いて、N-グリコシル化反応を試みることとした(Table
3-6)。この結果、望みとする N-グリコシル化反応は速やかに進行し、いずれの N-(ベンジ
ルオキシ)カルバミン酸エステルを用いた場合でも高い収率で目的の N-グリコシド 121 を 得ることができた。また、第 2 節で見たように、ヒドロキサム酸エステルを用いた N-グ リコシル化反応では、O-グリコシドの副成が見られたが、本反応系ではそのような副反 応は全く見られなかった。また、本反応は全ての系においてβ選択的に進行したが、この 要因は、Troc基に起因する隣接基関与の影響が大きく反映されたためと考えられる。
Cp2ZrCl2 AgOTf MS 4A CH2Cl2 -20 °C +
OBn
COOR yield (%) Alloc
Fmoc Cbz
83 (β only) 84 (β only)
121 116a-c
120
87 (β only) entry
1 2 3 RO N
H OBn O
O R O O
F NHTroc OAc AcO
AcO
O N NHTroc OAc AcO
AcO
Table 3-6. Glycosylation of Glycosyl Fluoride with Carbamate-derived Hydroxamate 116
このようにして生成した N-グリコシド 121aβは、2 位のアミノ基に対する Troc 基の脱 保護とそれに引き続くアセチル化96)、およびアノマー位におけるベンジルオキシ基の除去
を経て GlcNAc 誘導体 122aβへと変換できた(Scheme 3-8)。生成した 122βに対し、Figure
3-13 に示したようなAlloc の脱保護に伴うカップリング反応を行えば、不安定なグリコシ ルアミンを単離することなく、GlcNAcβ1→Asn をはじめとする種々の生物活性 N-グリコ シドへと誘導が可能である。
O NHTroc OAc AcO
AcO NAlloc
OBn O
NHAc OAc AcO
AcO NHAlloc
1) Zn / AcOH 2) Ac2O / Py 3) SmI2, MeOH / THF
122aβ 121aβ
75% (3 steps)
第 4 章
総 括
著者は、N-結合型糖タンパク質を合成する上で必要不可欠になる効率的な糖鎖の合成 法の開発や、新規な N-グリコシド結合の合成法の開発、複雑な骨格を有する糖鎖の合成 に取り組み、本論文においてその結果を報告した。以下、本論文で開発した新規反応と合 成を達成した糖鎖の合成法に関する総括を示す。これらの一連の研究により、N-結合型糖 タンパク質の化学合成に向けた効果的な方法論を提供できたものと考えている。
<1> 凍結反応場を利用した効率的糖鎖合成法の開発
p-キシレン(融点 : 12-13 ˚C)を溶媒とする種々のグリコシル化反応が、p-キシレンが凍結
する 4 ˚C という条件下において、劇的に加速されることを見いだした。p-キシレンと類 似の性質を有するトルエン(融点 : −93 ˚C)を用いたグリコシル化反応を、同様にトルエン が凍結しない 4 ˚C で行っても反応の加速は全くみられないことから、凍結反応場が反応 速度の向上に寄与していると考えられる。しかしながら凍結反応においては、グリコシル 化反応の立体選択性に顕著な相違を与えることも判明しており、凍結反応における立体制 御は今後の課題である。
＜凍結反応によるグリコシル化反応の反応加速＞
BnO O BnO
BnO OH
OBn BnO O
BnO
BnO OBn
SMe
BnO O BnO
BnO
OBn BnO O
BnO
BnO OBn
O MeOTf (2.5 eq.)
DTBMP (1.5 eq.) MS 4A solvent temp.
1.35 eq. 6 h
entry temp.
yield
% α : β 1
2
r.t.
4 °C
24 86
46 : 1 3.4 : 1 condition
frozen unfrozen
3 unfrozen 4 °C 11 16 : 1
solvent
p-xylene p-xylene toluene +
<2> 寄生虫由来の多分岐型N-型糖鎖の合成
寄生虫、日本住血吸虫及びマンソン住血吸虫の卵に存在する多分岐型 N-型糖鎖の合成 を達成した。この合成にあたっては、共同研究者の伊藤らによって開発された分子内アグ リコン転移反応を利用したβ-マンノシル化反応や超高圧条件下での脱シリル反応を効果的 に用いたほか、第1章において確立した凍結反応場を利用したグリコシル化反応も取り入 れた。また、糖鎖の機能発現に関与しているとされるキシロースやフコースの一部、もし くは全部を欠落させた非天然型糖鎖の合成も達成したが、これらの糖鎖はその機能を解明 する上で大きな役割を果たすと期待される。
＜フラグメントA及びAaの合成＞
O TBDPSO
O O
SMe OPMB
O TBDPSO
O OH O
O OBn O
OBn PhthN BnO HO O
BnO
NPhth OBn + OBn
Intramolecular Aglycon Delivery
Xylosylation or Acetylation
O TBDPSO
O OR O
O OBn O
OBn PhthN
BnO O
HO O OR O
O OBn O
OBn PhthN BnO Desilylation
under High Pressure
O O O
OBn PhthN
BnO OBn
BnO O BnO
NPhth
O OBn
OBn O OBn BnO
O HO BnO O
BnO
BnO OAc
O OR
O O O
OBn PhthN
BnO OBn
BnO O BnO
NPhth
O OBn
OBn O OBn BnO
O Glycosylation
and Deprotection
HO
HO Mannosylation
Derivatization
O O O
OAc PhthN
AcO O
AcO O AcO
NPhth
O OAc
OAc O OAc AcO
O AcO AcO O
AcO
AcO OAc
O
CCl3 NH OR
OR
O OAc
OAc AcO
Frgment A
Frgment Aa
R
Ac
＜フラグメントBbおよびBcの合成＞
HO O PMBO
NPhth OBn O
OAc BnO
AcO
O O
PMBO O O
NPhth OBn Ph
O PMBO
NPhth OBn HO
OH Reductive
Cleavage
Benzyliden Cleavage
O PMBO
NPhth OBn HO
OBn
Fucosylation Frgment Bc
Frgment Bb
＜糖鎖骨格の構築と脱保護＞
Glycosylation with
O O O
OAc PhthN AcO
O OAc
OAc AcO
O
AcO O AcO
NPhth
O OAc
OAc O OAc AcO
O AcO
O AcO
OAc
O AcO
AcO
O HO
NPhth OBn O
O O
AcO OAc BnO Deprotection
of PMB Group
O O O
OAc PhthN AcO
O OAc
OAc AcO
O
AcO O AcO
NPhth
O OAc
OAc O OAc AcO
O AcO
O AcO
OAc
O AcO
AcO
O O
NPhth OBn O
OAcOAc OBn
O O
AcOOAc BnO
O Glycosylation
under Frozen Condition
O O O
OH NHAc HO
O OH
OH HO
O
HO O HO
NHAc
O OH
OH O OH HO
O HO
O HO
OH
O HO
HO
O O
NHAc OH O
OHOH OH
O O
HO OH HO
O Deprotection
Frgment A
Frgment Bb
<3> ヒドロキサム酸エステルを用いたN-結合型糖アミノ酸の新規合成法
アスパラギン側鎖のカルボキサミドをヒドロキサム酸エステルへと変換し、これをグ リコシルアクセプターとしてグリコシルフルオリドとの間でグリコシル化反応を行えば、
中程度の収率ながら N-グリコシル化反応が進行し、N-結合型糖アミノ酸前駆体へと導け ることを見いだした。この前駆体は、引き続く SmI2を用いた一電子還元反応で容易に N- 結合型糖アミノ酸へと変換可能である。
＜ヒドロキサム酸エステルを用いたN-グリコシル化反応＞
O F OBn OBn BnO
BnO HN
OBn
O NHFmoc Ot-Bu O
O O OBn OBn BnO
BnO CCl3
NH MS 4A
CH2Cl2 -78 °C → r.t.
43%
α : β = 3.3 : 1
O N OBn OBn BnO
BnO
O NHFmoc Ot-Bu OBn O
TMSOTf +
MS 4A CH2Cl2 53%
α : β = 5.5 : 1 Cp2ZrCl2
AgOTf
＜SmI2を用いた一電子還元反応によるN-結合型糖アミノ酸への変換＞
O BnO OBn BnO
BnO
N
O NHFmoc Ot-Bu O
O BnO OBn BnO
BnO
HN
O NHFmoc Ot-Bu O BnO
SmI2 MeOH
THF 88%
Glcα1→Asn
<4> 分子内N-グリコシル化反応を用いたN-結合型糖アミノ酸の新規合成法
前出のヒドロキサム酸エステルを用いた N-グリコシル化反応の欠点を克服すべく、分 子内 N-グリコシル化反応を用いた新規な N-結合型糖アミノ酸の合成法の確立を試みた。
本研究では、設計した糖-アミノ酸複合体の合成を達成すると共に、これを用いた分子内 N-グリコシル化反応の反応系を確立した。また、これにより生成した環化合物は SmI2を 用いた一電子還元反応でN-結合型糖アミノ酸へと変換可能である。
＜分子内N-グリコシル化反応＞
O R O BnO
BnO
O NHFmoc Ot-Bu O HN
O O
R OBn
OBn
NHFmoc O CO2t-Bu N
SMe
MS 4A CH2Cl2 -20 °C PhSeOTf
yield (%) 29 51 R
N3 NHTroc
＜SmI2を用いた一電子還元反応によるN-結合型糖アミノ酸への変換＞
O NHAc OAc BnO
BnO
O NHFmoc Ot-Bu H O
N O
O
N3 OBn
OBn
NHFmoc O CO2t-Bu
N O
NH2 OH BnO
BnO
O NHFmoc Ot-Bu H O
N 4SmI2
THF
H2O
Ac2O Py 32%
(2 steps)
<5> N-(ベンジルオキシ)カルバミン酸エステルを用いたN-グリコシル化反応
N-(ベンジルオキシ)カルバミン酸エステルとグリコサミン誘導体とのグリコシル化反 応により、β-N-グリコシドが選択的に得られ、引き続く官能基変換によって GlcNAc 誘導 体へと変換できた。得られた N-グリコシドは、Alloc の脱保護とカップリング反応を同一 系内で行うことにより、不安定なグリコシルアミンを経由することなく種々の生物活性 N-グリコシド誘導体へと誘導可能である。
＜N-グリコシル化反応とグルコサミン誘導体への変換＞
O F NHTroc OAc AcO
AcO
Cp2ZrCl2 AgOTf MS 4A CH2Cl2 -20 °C 83%
O NHTroc OAc AcO
+ AcO NAlloc
OBn AllocHN OBn
OAc 1) Zn / AcOH
2) Ac2O / Py