博士（医学）原 敬志 学位論文題名
ストレプトゾトシン投与マウスにおける 膵 ラ ン ゲ ル ハ ン ス 島 の 変 化
学位論文内容の要旨
I． 目 的
糖 尿 病 の 膵 内 分 泌 部 ラ ン ゲJレ ハ ン ス 島 （ ラ 島 ）の変 化を 理解 する ため に， 実験 的 糖 尿 病 を 発 生 さ せ る ス ト レ プ ト ゾ ト シ ン （SZ） を マ ウ ス に 投 与 し ， 膵 臓 を 経 時的 に 観 察 し た ． と く に イ ン ス リ ン 分 泌 量 に 関 連 し て， す べ て の ラ 島 が 観 察 で き るよ う に ， 一 定 間 隔 の 膵 全 体 の 連 続 切 片 を 作 成 し ， 切 片上 の す べ て の ラ 島 を 計 測 し ，ラ 島 の 直 径 ， 総 数 ， 総 体 積 と 内 分 泌 細 胞 の 種 類 に よ る量 的 変 化 を 立 体 組 織 定 量 学 的に 求 め た ．
n .材 料 と 方 法
動 物 は 雌 性dd‑マ ウ ス 総 計75匹 を 用 い ， 正 常 対 照 群 （ 例 数‑15， 正 常 マ ウ ス を 生 後 5，7週 齢 で 屠 殺 し た 対 照 群 ） ，SZ投 与 群 （ 例 数=50， 生 後5週 齢 で150mg/kg の SZ（ C8Hi5N307） を 1日1回 ， 連 続 2日 間 腹 腔 内 注 射 後3，6，12時 間 ，1， 2，3，7，14日 で 屠 殺 し た 群 ） ， 生 理 的 食 塩 水 投 与 群 （ 例 数=10， 生 後5週 齢 で 生 理 的 食 塩 水 を 同 様 の 手 技 で 注 射 後14目 で 屠 殺 し た 群 ） の3群 に わ け た ． マ ウ ス を 屠 殺 す る 際 に は 血 糖 値 を 測 定 し た ・
各 齢 期5例 ず つ の マ ウ ス に つ い て ， 膵 全 体 の 連 続 切 片 を 作 成 し ， 切 片 は ヘ マ ト キ シ リ ン ー エ オ ジ ン 染 色 ， ア ル デ ヒ ド ーフ クシ ン染 色を 行い， 光学 顕微 鏡で 観察 した ． 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 で はA細 胞 ，B細 胞 ，D細 胞 を 同 定 し た ．
組 織 学 的 立 体 定 量 で は ，200メm間 隔 の 膵 臓 全 体 の 切 片 上 の す べ て の ラ 島 の 面 積 を 計 算 し ， そ の 平 均 値 と 切片 の 厚 さ ， 切 片 間 隔 を も と に ラ 島 の 直 径 ， 総 体 積 ， 総 数 を 求 め た ． さ ら に ， 膵 臓 の 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 を 行 っ た マ ウ ス1匹 当 た り20個 の ラ 島 を 任 意 に 選 び ， A， B， D細 胞 の 比 率 か ら 各 細 胞 の 総 体 積 を 算 出 し た ．
m． 結 果
血 糖 値 は ， 正 常 で は210土50mg/dlで あ っ た が ，SZ投 与 後3日 目 ま で 急 速 に 上 昇 し ， 平 均 約500mg/dlと な っ た ． そ の 後 の 血 糖 の 上 昇 は わ ず か で あ っ た ． ア ル デ ヒ ド ・ フ ク シ ン 染 色 で イ ン ス リ ン 分 泌 細 胞 で あ るB細 胞 が ラ 島 の 大 部 分 を 占 め た ．SZを 投 与 す る と ，12時 間 後 で 多 く のB細 胞 の 核 が 濃 縮 し ， く び れ た り ， 分 断 さ れ て い た ．1日 で は ラ 島 内 に 多 数 の マ ク ロ フ ァ ー ジ が 出現 し ， 分 断 し たB細
胞 の 胞 体 を 貪 食 し て い た が ，3日 で あ ま り 見 ら れ な く な っ た ． 14目 後 で は， 明 ら か なB細 胞 の 染 色 性 を 示 す 胞 体 は ほ と ん ど な かっ た ．
免 疫 組 織 化 学 的染 色 ： 構 成 細 胞 数 の 少 な い 小 さ な ラ 島 を み る と ， 正 常 で切 片 上 の 直 径 が30ルm以 下 の ラ 島 は ，B細 胞 の み で 構 成 さ れ ，30〜50Um以 下 の ラ 島 で は ， B細 胞 以 外 の 細 胞 は 少 数 で あ っ た ．SZ投 与 後 ， 切 片 上 で 直 径30〃m以 下 の ほ と ん ど の ラ 島 は ，A細 胞 の み で 構 成 さ れ て い た ． ま た ， 腺 房 細 胞 間 に 孤 立 し て 散在 す る A細 胞 も し ば し ば 観 察 さ れ た ． B細 胞 の み で 構 成 さ れ た ラ 島 は な か っ た ． 隣 接 切 片 で 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 と ァ ル デ ヒ ド・ フ ク シ ン 染 色 を 施 しB細 胞の 染 色 性 を 観 察 す る と ， 正 常 のB細 胞 は す べ て 十 分 な 染 色 性 を 示 し た が ，SZ投 与 後14 日 後 のB細 胞 は 様 々 に 染 色 性 が 低 下 し て い た ．
ラ 島 の 直 径 ， 総 数 ， 総 体 積 は ，SZ投 与 後1日 よ り 減 少 し ，3日 で そ れ ぞ れ 正 常 の86.6％ ，79.6％ ，51．9％ と な り ， そ れ 以 降 は 緩 徐 に 減 少 し た ．A細 胞 の総 体 積 は ほ と ん ど 変 化 し な か っ た が ，B細 胞 とD細 胞 の 総 体 積 は そ れ ぞ れ3日 後 で 正 常 の 約 24％ ， 86％ に 減 少 し ， 14日 後 で は 正 常 の 約11％ ， 76％ と な っ た ．
1V． 考 察
こ れ ま で ラ 島 の 大 き さ ， 総 数 ， 総 体 積 の 変 化 は ， す べて ， 膵 の 一 部 の 切 片 にお け る ラ 島 の 大 き さ と 数 を 計 測 し ， 計 算 さ れ て き た ． こ の 値は 膵 臓 内 で ラ 島 が 均 等に 分 布 す る 場 合 に は 正 し い が ， 実 際 に は ， ラ 島 の 分 布 は 膵 臓内 で 不 均 一 で あ る の で． こ れ ま で の 方 法 で は 正 し い 値 を 算 出 す る こ と は で き な ぃ ．ま た ， ラ 島 の 大 き さ も， こ れ ま で は 一 部 の 切 片 に 出 て く る も の の み を 計 測 し て い るの で ， 立 体 計 量 的 に 正し く は 求 め ら れ て い な い ． さ ら に ， ラ 島 の 数 そ の も の に つ いて も 切 片 に 出 て く る 数で 全 体 の 数 を 論 じ て い る が ， 大 き さ が 変 化 す る 場 合 ， 切 片 に出 現 す る 数 の み で は 立体 と し て の ラ 島 の 数 を 正 し く は 求 め ら れ な い ．
こ こ で は ， ラ 島 の 大 き さ と 総 数 お よ び 総 体 積 を 求 め るた め ， 一 定 間 隔 で 膵 全体 の 連 続 切 片 を 作 成 し ， 切 片 上 に 現 れ た ラ 島 の す べ て を 計 測し た ． こ れ に よ っ て ，分 布 に か た よ り の あ る ラ 島 の 大 き さ ， 総 数 ， 総 体 積 を 正 確 に評 価 で き る よ う に な った ． ラ 島 の 大 き さ の 変 化 を 加 味 し た ラ 島 の 総 数 ｜ ま ，SZ投与 に よ り 減 少 し ， 一 週で 正 常 の 約3分 の2と な っ た ．SZ投 与 後3日 で ラ 島 の 直 径 と 総 数 の 両 者 が 著 明 に 減 少 し た こ と は ， ラ 島 の あ る も の が 縮 小 し ， 消 失 す る こ と を 示 唆 す る ． ラ 島 の 構 成 細 胞 に つ い て は ，B細 胞 はSZ投 与 後 ， 核 が 濃 縮 し ， マ ク ロ フ ァ ー ジ に 貪 食 さ れ 消 失 し た ． こ の こ と はB細 胞 の 消 失 過 程 が ア ポ ト ー シ ス に よ る こ と を 強 く 示 唆 す る ．
ラ 島 の 消 失 過 程 を み る と ， ま ず ，B細 胞 の み で 構 成 さ れ て い る こ と が 多 い30pm 以 下 の ラ 島 で ，SZ投 与 後 B細 胞 が 消 失 し た ． 一 方 ，SZ投 与 後 ，A細 胞 の み の 小 さ な ラ 島 と ， 腺 房 細 胞 間 に 散 在 性 に 孤 立 し てA細 胞 が 出 現 し た こ と は ， 正 常 で 少 数 な が らA細 胞 が 存 在 す る 直 径30〜50〃mの ラ 島 のB細 胞 が 消 失 し てA細 胞 の み に な る こ と を 推 察 さ せ る ． す な わ ち ， 正 常 で 切 片 上 の 直 径 が約50pm以 下 の 小 型 ラ 島は ， SZ投 与 に よ り 消 失 す る 可 能 性 が あ る ．
一 方 ， 中 型 以 上 の ラ 島 はSZ投 与 後 縮 小 し ， ラ 島 内 のB細 胞 は 様 々 に 染 色 性 が 低 下 し た ．B細 胞 の 様 々 な 染 色 性 の 低 下 は ，B細 胞 の イ ン ス リ ン 顆 粒 の 量 が 様 々 に 減 少 し た こ と を 示 唆 す る ． っ ま り ，SZ投 与 に よ り ，B細 胞 は 数 が 減 少 す る の み な ら ず ， 残 っ た B細 胞 の 内 分 泌 機 能 が 低 下 す る こ と が 推 察 さ れ る ．
V.結 語
1.膵 臓全 体の一定 間隔の連続 切片を作成 して切片上 のすぺての ラ島を計測 するこ と により，ラ 島の大きさ と総数の評価が可能となり，ストレプトゾトシン投与によ る ランゲルハ ンス島の縮 小と消失をはじめて明らかにした．この手法により，大き さ と 分 布 が 不 均 一 な 粒 体 組 織 の 直 径 と 総 数 が 評 価 で き る よ う に な っ た ． 2． スト レ プ トゾ ト シン 投 与に よ り， ラ 島の一 部のB細 胞は消失し ，残存B細胞の イ ンスリン顆 粒は減少し た．このこ とは，糖尿 病膵ではB細胞の総数が減少し，残 存B細胞の 機能が低下 しているこ とを示唆す る．
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
ストレプトゾトシン投与マウスにおける 、 膵 ラ ン ゲ ル ハ ン ス 島 の 変 化
糖尿病 は，膵ラ ンゲルハ ンス島（ラ 島）のB細 胞から分 泌される インスリ ンの絶対 的な いし 相対的不 足に基づ ぃた疾患 である．こ の際，ラ 島が縮小 ，消失していくことが考えら れる が，切片 からは不 明確であ り，膵全体 で定量化 されたこ とはない．そこで本研究は，
ス ト レプ ト ゾト シ ン （SZ） で糖 尿病モ デルを作 成し，ラ 島の組織 学的変化 およびそ の進 行を 定性なら びに定量 的に明ら かにするこ とを目的 とした．
動 物 は5週 齢の 雌ddマ ウ ス 総計75匹 を 用 い， 正 常対 照 群 （例 数=15，正 常 マウ ス を 生 後5，7週 齢 で屠 殺 した 対 照 群） ，SZ投与 群（例数 二二ニ50， 生後5週齢 で15 0m g/kgのS Z（C8Hi5N307） を1日1回 ， 連 続2日 間 腹 腔 内 注 射 後 ，3，6，12時 間 ，1，2，3， 7，14日で 屠 殺し た 群 ）， 生 理 的食塩水 投与群（ 例数二ニ10，生後5週 齢で生理 的食塩水 を 同 様の 手 技で 注 射 後14日 で屠 殺 した 対 照 群） の3群 にわ け た． マウスを 屠殺する 際に は 血 糖値 を 測定 し た ．各 齢 期5例ず つ の マウ ス につ い て ，膵 全 体 の200pm間 隔 の 連続 切 片を 作成し， 切片はへ マトキシ リン・エオシン染色，アルデヒド・フクシン染色またはA， B， D細 胞 を 同 定 す る 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 を 行 い ‥ 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た ． 組織 学的立体 定量では 膵臓全体 の連続切片 から，す べてのラ 島の面積を計測し，立体解 析学 を応用し た新たな 手法によ り，ラ島の 直径，総 数，総体 積を求めた．さらに，免疫組 織化 学的染色 切片を用 いて，A，B，D細胞の総 体積を求 めた，
そ の 結 果 ， 血 糖 値 は ， 正 常 で は210土50mg/dlで あ っ た が ，SZ投 与 後3日 目 ま で 急 速 に 上 昇 し ， 平 均50 0m g/dlと な っ た ． そ の 後 の 血 糖 の 上 昇 は わ ず か で あ っ た ． ラ島 は大きさ と膵臓内 での分布 が不均一で あった． アルデヒ ド・フクシン染色標本では 正 常 のB細胞 は 紫色 に 明 瞭に 染 色され ，ラ島の 大部分を 占めてい た． SZを投 与すると ， 12時 間 後 で 多 く のB細 胞 の 核 が 濃 縮 し ， 胞 体の 染 色性 が 低 下し て いた ．1日 後 のB細胞 は ， 胞 体 が 分 断 し ， マ ク ロ フ ァ ー ジ に 貪 食 さ れ て ぃ る も の が 多 く 観 察 さ れ た ． 免 疫 組 織化 学 的 染色 標 本 では ， 正常 で ， 切片 上 直径50ヰm以下 の ラ島 は ，B細 胞以 外 の 内 分 泌 細 胞 は ご く 少 数 で あ っ た.SZ投 与 後 ， 切 片 上 直 径30〃m以 下 のラ 島 は ，ほ と んど がA細胞で あった．
隣接 切片でア ルデヒド ・フクシ ン染色と免 疫組織化 学的染色 を行い，比較すると，正常 のB細 胞 は す べ て 十 分 な 染 色 性 を 示 し た が ，SZ投 与14目 後 で は ，B細 胞は 様 々 に染 色 性が 低下して いた．
定 量 的 変 化 で は ， ラ 島 の 直 径 ， 総 数 ，総 体 積は ，SZ投 与3日 後 でそ れ ぞれ86.6％ ， 79.6％ ，51.9％ に 急 速に 減 少 し， そ の後 の 減 少は 緩 徐と な っ た．B， 細 胞の 総 体 積は3
之 厚
博
紘 和
正
藤 部
香
加 阿
浅
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
日後で正常の24 ％，14 日後で11 ％に減少した．A ，D 細胞の総体積はあまり変化がなか った．
以上の結果から，SZ 投与による糖尿病膵のラ島の量的変化の進行を明らかにできた．
本研究の膵全体の切片における計測手法は，大きさと分布が不均一なラ島の定量に有用で あった．
口頭発表において，浅香正博教授より，ヒトとマウスの膵臓の解剖学的な相違，実験動 物の選択，SZ のB 細胞に対する障害機序ならびに障害特異性，糖尿病マウスの血中イン スリン濃度とA 細胞の機能亢進の有無，SZ 障害ラ島とインスリン依存性，非依存性糖尿 病のラ島について，阿部和厚教授より，ヒトの糖尿病の膵ラ島の定性定量的病理所見と内 分泌細胞の染色性，SZ 投与マウスのB 細胞の大きさの変化，B 細胞の染色性の低下の意 味，A 細胞の変化，ラ島の大きさの分布について，加藤紘之教授より，B 細胞の消失過程，
ヒトとSZ 投与マウスにおける糖尿病の相違点，ヒトのラ島定量への臨床応用についての 質問があったが，申請者はおおむね妥当な回答をした．
