博士（医学）晴山仁志 学位論文題名
抗 PCNA 抗体を用 いた正常子宮内膜，
内膜増殖症および子宮体癌の細胞増殖能の検討 学位論文内容の要旨
I． 緒言
正 常 の 性 周 期 を も つ 性 成 熟 婦 人 の 子 宮 内 膜 は 短 期 間 に 規 則 正 し く 増 殖 ， 分 泌 ， 剥 脱 を 繰 り 返 す ． 一 方 ， 子 宮 内 膜 の 悪 性 腫 瘍 は 無 制 御 の 自 律 的 な 増 殖 を 特 徴 と す る ． 悪 性 腫 瘍 を 扱 う 場 合 ， 個 々 の 病 理 組 織 学 的 所 見 を 詳 細 に 把 握 す る こ と は 重 要 で あ る が ， そ の 他 に 腫 瘍 細 胞 の 細 胞 増 殖 能 な ど の 生 物 学 的 特 性 を 考 慮 レ て 適 切 な 治 療 を す る こ と が 望 ま れ る ． 腫 瘍 細 胞 の 細 胞 増 殖 能 を 調 べ る 方 法 と レ て ， 近 年 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 作 製 の 技 術 と 増 殖 期 の 細 胞 核 内 蛋 白 の 分 析 が 進 み ， そ れ ら の 核 抗 原 に 対 す る 特 異 的 な 抗 体 を 用 い て 免 疫 組 織 化 学 的 に 細 胞 の 増 殖 性 を 解 析 す る こ と が 容 易 に な っ た ． PCNA(Prolifcrating Ccll Nuclear Antigen)は細 胞周期のG1後期からS期に合 成される DNA polymerase‑6の 補 助 蛋 白 で 細 胞 増 殖 関 連 物 質 の ひ と つ で あ る ． 本 研 究 で はPCNAに 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(PC10)を 用 い て 正 常 子 宮 内 膜 ， 子 宮 内 膜 増 殖 症 ， 子 宮 体 癌 組 織 の 細 胞 増 殖 能 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 索 し ， さ ら に 子 宮 体 癌 の 予 後 を 反 映 す る 病 理 組 織 学 的 因 子 な ど と の 関 連 性 に つ い て 検 討 し た ．
II．対象と方法 1． 対 象
リ ン パ 飾 郭 清 を 加 え た 根 治 手 術 を 施 行 し た 子 宮 体 癌60例 （ 内 膜 型 腺 癌52例 ， 腺 棘 細 胞 癌3例 ， 腺 扁 平 上 皮 癌5例 ） ， 子 宮 内 膜 増 殖 症12例 （ 嚢 胞 性 腺 増 殖 症6例 ， 腺 腫 性 増 殖 症6例 ） ， 正 常 の 子 宮 内 膜 組 織44例 （ 性 成 熟 期 婦 人36例 と 閉 経 後 の 婦 人8例 ） を 対 象 と レ た ． 採 取 さ れ た 組 織 を10％ ホ ル マ リ ン 固 定 し ， パ ラ フ ィ ン 包 埋 後4pmの 迎 続 切 片 を 作 製 しH&E染 色 と 免 疫 組 織 化 学 染 色 を 施 行 し た ．
2． 免 疫 組 織 化 学 染 色
免 疫 組 織 化 学 染 色 はSAB法 で 行 な っ た ． キ シ レ ン ， エ タ ノ ー ル で 脱 パ ラ フ ィ ン し，
0.6％ 過 酸 化 水 素 含 メ タ ノ ー ル で 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ を 抑 制 し ， 正 常 ウ サ ギ 血清 で 反 応 さ せ た ． そ の 後 一 次 抗 体 と し て 抗PCNAマ ウ ス モ ノ ク 口 ー ナ ル 抗 体(PC10， DAKO)を1%BSA含PBSで 希 釈 し て 反 応 さ せ た ． 二 次 抗 体 は ビ オ チ ン 化 抗 マ ウ ス 血 清 を 用 い ，HRP標 識 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン で 反 応 さ せ た ， 発 色 はAECに て 行 い ， 蒸 留 水 で 反 応 停 止 後 に へ マ ト キ シ リ ン で 核 染 し 検 鏡 レ た ．
3． 研 究 方 法
陽 性 細 胞 は 核 の み が 染 色 さ れ ， 最 も 強 く み ら れ た 部 位 を 中 心 に 数 力 所 の 視 野 を 選
び，400倍にて観 察した．1000個の細胞 を数え， そのうちの 陽性細胞 数の比率を算出 しPCNA陽 性率 と した ． 正 常子 宮 内 膜， 内 膜増 殖 症 ，子 宮 体癌 のPCNA陽 性率を 求め た ． また 子 宮 体癌におけ るPCNA陽性率 と病理組 織学的因 子などと の関連性 について 検討 レた．統 計学的に2群間の比較はWilcoxon検定を用い，生存曲線はKaplan‑Mcicr法 で 示 し ， そ の 有 意 差 検 定 は gcncralizcd Wilcoxon tcstを 用 い た ．
III.結 果 1．正常の子宮内膜組織
増 殖期 後 期 のPCNA陽 性 率(26.8土2.7％ ，mcan+SE)が 最 も 高く ， 増殖 期 前 期(6.4 土2．9％）（pく0.001)，分泌期初・中期(12.5土3．4D／。）（pく0.01)，分泌期後期(0.2土 0．1％）（pく0.001)，閉経後の正常内膜(4.4土1.40/0)（pく0.001)よりもそれぞれ有意に高 値を示した，
2.子宮 内膜増殖 症組織
子宮 内膜増殖 症の12例は すべて閉 経前の症 例であった ．PCNA陽性率は15.4土5.7％ で， 閉経前の子宮体癌のPCNA陽性率17．1土4.1％および増殖期内膜18.9土3.1％との問 には 有意差は 言忍めら れなかっ た．また嚢胞性腺増殖症と腺腫性増殖症との間にPCNA 陽性 率の差は 観察され なかった ．
3.子宮体 癌組織
子宮 体癌60例中 閉経前の 症例は17例(46.3土1.0歳）， 閉経後の症 例は43例(59.4 土1.0歳） であった ．閉経前 の子宮体 癌のPCNA陽性 率(17.1土4．1％）と増殖期全体 の18例の 内膜の陽 性率(18.9土3．1％）との間に有意差はみられなかったが，閉経後 の子 宮体癌のPCNA陽性率(19.9土2．6％）は 閉経後の 正常内股の 陽性率よ りも有意 (pく0.005)に高 値を示し た．
4.子宮体癌組織のPCNA陽性率と病理組織学的因子との関係゛
臨床進行期(FIG0(1983年））別(Ia期(16例）：21．3土4．1％，IblUJ(25例）：15．9土2．8％，
H期(19例 ）：21．5土4．7％），付属器転移の有無別（転移あり(12Wij):26.1土5.4％，転移な し(48例）：18．5土2．4 r70)，組織分化度別(G1(25例）：15．9土2.8%，G2(27例）：20．5土3．4％，
G3(8例） ：27．8土8．5 010)では， それぞ れ有意の 差は認 められなかった．レかし子宮頸部 浸潤 のある群(19例，26.6土4.40'/0)が 浸潤のな い群(41例，15.6土2.3 0̲10)（pく0.05)よ り も， 核 異 型 度の 強 いgrade3（8例，34.8土6．2％ ） とgrade2(24例 ，24.1土3.8 u/o)が gradel(28例 ，10.4土1．6％ ）(pく0.001，pく0.01)よ り も， 筋 層 浸潤1/3を 越 える群(44 例 ，22.9土2.6010)が1/3以下 の 群(16例 ，8.8土2．6％ ）(pく0.005)よ り も， 脈管 侵襲群 (31例，25.1土3．4％）か 侵襲の認 められ ない群(29例，13.0土2.3 u/o)（pく0.01)よりも，
リ ンパ 節 転 移 群(18例，31.0土4．8％ ） が転 移 陰 性群(42例，14.0土1.9％ ） （pく0.005) よ り も そ れ ぞ れ 有 意 に 高 値 を 示 し た ． ま た り ン パ 飾 転 移 を‑2Jめ た12例 の 原 発 部位 で は35.0土6.0％ のPCNA陽 性 率 で あ り ， 転 移 リ ン パ 飾 で は26.4土8.7％ と 原 発部 位 よ り も 低 値 を 示 し た が ， 両 群 間 に 有 意 差 は 言 忍 め ら れ なか っ た ．さ ら に 原発 部 位 と転 移 リ ン パ 節 の PCNA陽 性 率 の 差 異 と 転 帰 に 関 し て は ， 一 定 の 関 係 は 認 め ら れ な か っ た ． 5. PCNA陽性率と 予後との 関係
生存曲線 の解析（ Kaplan‑Mcier法）で，PCNA陽性率25%未 満の群(39例） の予後は 25％ 以 上 の 群 (21例 ） よ り も 有 意 （ pく 0.05)に 良 好 で あ っ た ．
IV.
考 察
G1
後期からsrJ の細胞核に検出される
PCNAに対するモノクローナル抗体(PC10) を 用いて正常子宮内膜，子宮内膜増殖症，子宮体癌を対象に免疫組織化学的に検索し，
以下の結論が得られた．
1
．正常子宮の増殖期後期内膜の
PCNA陽性率が最も高く，分泌期初・中期に下降し 分 泌 後 期 に は 最 低 値 を示 レ た． ま た閉 経 後の 内 膜で 著 明な 低 下を 認 め た．
2
．子宮内膜増殖症の
PCNA陽性率と増殖期内膜，子宮体癌の
PCNA陽性率との間に 差は認められなかった．
3
．閉経後の子宮体癌のPCNA 陽性率は閉経後の正常内膜よりも著明に亢進している が，閉経前の子宮体癌のPCNA 陽性率は性周期をもつ婦人の短期間に増殖する内膜と はほとんど差がないものと考えられた．
4.
子宮体癌において核の異型性の強い腫瘍細胞とPCNA 陽性率との関連性がみられ，
陽性率の高い例で頸部浸潤，体部筋層への深い浸潤傾向を示し，さらに脈管侵襲，リ ンパ飾転移を起こすことが示唆された．
5
．生存曲線の解析でPCNA 陽性率25 ％未満の群の予後は25 ％以上の群よりも有意に良 好であった，
以上から，PCNA の免疫組織染色所見は子宮内膜腺細胞の細胞増殖能を十分に反映
し，子宮体癌においてはPCNA 陽性率の高い症例は増殖活性が高く，PCNA 陽性率と
悪性度とが関述していることが示唆された．従って，本法は子宮体癌の予後を推定す
るうえで，さらには手術治療後の追加治療を選択するために臨床的にきわめて有用で
あることがはじめて確認された．
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
抗 PCNA 抗 体 を 用 い た 正 常 子 宮内 膜 ，
内 膜増殖 症および子宮体癌の細胞増殖能の検討
PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)は 細 胞 周 期 のGl後 期 か らS期 に 合 成 さ れ るDN A polyrnerzse‑6の 補 助 蛋 白 で 織 包 増 殖 関 連 物 質 の ひ と つ で あ る 。 本 研 究 で はPCNAに 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 （PC10） を 用 い て ， 正 常 子 宮 内 膜 ， 子 宮 内 膜 増 殖 症 ， 子 宮 体 愚 組 織 の 紅 泡 噌 殖 能 を 免疫 粗蕎 イ黼 っに 検索 し ，さ らに 子宮 体愚 の予 後を 反映 する 病理 組織 学的 因子 な どと の焚連性につ い て検 討し た。
リ ン バ 節 覇 靖 を 加 え た 根 治 手 術 を 施 行 し た 子 宮 体 甚60例 （ 内 膜 型 腺 癌52例 ， 腺 蕀 細 魅 憲3例 ， 腺 扁 平 ヒ 皮 癌5例 ） ， 子 宮 内 膜 増 殖 症12例 （ 嚢 胞 性 腺 増 殖 症6例 ， 腺 腫 性 増 殖 症6例 ） ， 正 常 の 子 宮 内 腹 組 織44例 （ 性 成 熟 斯 婦 人36例 と 閉 経 後 の 婦 人8例 ） を 本 研 究 の 対 象 と し た 。 採 取 さ れ た 組 織 を10％ ホル マ リン 固定 し， パラ フィ ン包 埋後4Umの 逗妾 ミ′L切 片を 作 製しH＆E染色 と免 碧藷 臥謝 ヒ 学染 色を 施 行し た。
免 鎮 黼 イ ヒ 学 染 色 はSAB法 で 行 な っ た 。 キ シ レ ン ， エ タ ノ ― ル で 脱 パ ラ フ ィ ン し ，0.6％ 過 蟹 化 水 素 含 メ タ ノ ー ル で 内 匱 性 ベ ル オ キ シ ダ ― ゼ を 抑 制 し ， 正 常ウ サギ 血 清で 反応 させ た。 その 後一 次 抗 体 と し て 抗PCNAマ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル ´ 抗 体 （PC10，DAKO） を1％BSA含PBSて 希 釈 し て 反 応 さ せ た 。 ニ 識 〔 体 は ビ オ チ ン イ ヒ 抗 マ ウ ス 血 清 を 用 い ，HRP識 ス 卜 レ プ 卜 ア ビジ ンで 反 応 さ せ た 。 発 色 はAECに て 行 い ， 蒸 留 水 で 反 応 停 止 後 に へ マ 卜 キ シ リ ン で 核 染 し 検 鏡 し た 。 陽 性 細 胞 は 核 の み が 染 色 さ れ ， 最 も 強 く み ら れ た 部 位 を 中 心 に 数 カ 所 の 視 野 を 選 び ，400倍に て 観 察 し た 。1000個 の 細 胞 を 数 え ， そ の う ち の 陽 性 知 胞 数 の 比 率 を 算 出 しPCNA陽 性 率 と し た 。 正 常 子 宮 内 膜 ， 内 膜 増 殖 症 ， 子 宮 体 癌 のPCNA陽 性 率 を 求 め た 。 ま た 子 宮 体 癌 に お け るPCNA陽 性 率 と 病 理 組 織 学 的 因 子 な ど と の 関 連 性 に つ い て 検 討 し た 。 統 計 学 的 に2間 の 比 較 はUiilcoxonを 用レ ヽ， 生 存曲 線はXaplanーHeier法 で 示し ，そ の有 意差検定はgenerzulized胃ilcoxonteStを用いた。
研究成績は以下の如くである。
1） 正 常 の 子 宮 内 膜 組 織 に お い て ， 増 殖 期 後 期 のPCNA陽 性 宰 （26.8土2．7名 ，mean土SE)が 最 も 高 く，増殖期前期(6.4土2．9卿（p〈0．001），分泌期初・中期(12.5土3．4苅b〈0．01），分泌期後期(0．2士 0．1問b〈0．001） ，麗 経後 の正 常内 膜(4.4土1．4%) (p<0. 001)よりもそれそれ曹意に高値を示した。
2） 閉 経 前 の 子 宮 内 膜 増 殖 症 組 織 に お し ヽ て ，PCNA陽 性 率 は15. 4+5.7Xで ， 閉 経 前 の 子 宮 体 蓮 のP CNA陽 性 率17.1土4.1%Sよ び 増 殖 期 内 膜18.9士3.1%と の 闇 に は 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 嚢 胞性諌増殖症と腺腫性増殖症との 間にPCNA陽性率の差は観察されなかった。
3） 子 宮 体 癌60例 中 閉 経 前 の 症 例 は17例(46.3土1‐O歳 ） ， 閉 経 後 の 症 例 は43例 （59.4士1．0歳
郎 暹 一 征 一 研 本 巻 間 藤 葛 本 授 授 授
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主 副
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） で あ っ た が ， 閉 経 前 の 子 宮 体 癌 のPCNA陽 性 率 （17.1土4．1噐 ） と 増 殖 期 全 体 の18例 の 陽 佳率 （ 18．9士3．1％） との 間に 有意 差 はみ られ なか った 。し かし ，閉 経後 の子 宮体 癌のPCNA陽 性率 （19.9 土 2．6％ ） は 閉 経 後 の 正 常 内 膜 の 陽 性 率 よ り も 有 意(p<0. 005)に 高 値 を 示 し た 。 4） 子 宮 依 愚 組 織 のPCNA陽 性 率 と 病 理 組 織 学 的 因 子 と の 関 係 ， す な わ ち ， 箆 床 進 行 期 （FIG〇
（19 83‑q)） 別 （Ia期 （16例 ） ：21.3士4.1%，Ib期 （26例 ） ：15.9土2.8%， 皿 期 （19例 ）
：21.51‑4. 7%)，付 属暑 き 転移 の有 無別 （転 移あ り812例） ：26.1土5．4気転 移なし（48例）：18．5 士2．4卿 ，組 織分 イヒ 農男I亅 （Gl（25例 ）：15．9土2.8%，G2（27例 ）：20.5土3．4覧 ，G3（8例 ）
：27．8土8．5め の検 討で は， それ ぞれ 有意 の差 は認 められなかった。しかし子宮 頸部浸潤のある詳（
19例，26．6土4．4％ ）が 浸潤のなレヽ詳（41例，15．6土2．3名〕(p<0. 05）より も，核異型度の強い gr甜e3（8例 ，34.8土6．2噐 ） とgrade2（24例 ，24.1土3．8噐 ） がgradel（28例 ，10.4土1．6覧
）(p<0. 001，p<0. 01）よ りも ，筋 層浸 潤1/3を越 える 詳（44例 ，22.9土2．6覧） が1/3以下 の詳 （l 6例，8.8土2．6啣b〈O．005）よりも，脈管侵襲群（31例，25.1土3，4甓）カi曇襲の認められない詳（2 9（29例 ，13．O土2．3％ ）(p<0. 01）よりも，リンバ節転移詳（18例，31.0土4．8％）カ蓮云移蔭性詳
（42例，14．0士1．9％）（p〈0．005）よりもそれぞれ有意に高値を示した。妄たりンノヾ節転移を諺めた 12土 例 の 原 発 部 位 で は35.0土6.0% PCNA陽 性 率 で あ り ， 転 移 リ ン バ 節 で は26. 4+8.7％ と 原 発 部 位 よ り も 低値 を示 レた が， 両詳 間に 有意 差は 認め られ なか っ た。 さら に原 発部 位と 転移 リン バ節 のP CNA陽性率の差異と転帰に関しては，一定 の関係は認められなかった。
5）PCNA陽 性 率 と 予 後 と の 関 係 す な わ ち 生 存 曲 線 の 解 析 （ Kaplan‑ldeier法 ） で ，PCNA陽 性 率 25％ 未 満 の 詳 （39例 ） の 予 後 は25％ 以 上 の 詳 （21例 ） よ り も 有 意(p<0. 05） に 良 好 で あ っ た。
以 上 の 研 究 成 績 か ら ，P C‑NAの 免 疫 組 織 染 色 所 見 は 子 宮 内 膜 騾 細 胞 の 細 胞 増 殖 能 を 十 分に 反映 し ， 子 宮 体 癌 に あ レ ヽ て はPCNA陽 性 率 の 高 い 症 例 は 増 殖 活 性 が 高 く ，PCNA陽 性 率 と 悪 性 宝 と が 関 連 し て い ろ こ と が 示 唆 さ れ た 。 従 っ て ，PCNAは 子 宮 体 癌 の 予 後 を 推 定 す る う え で ， さ らに は手 術 浩 寮 後 の 迫 力 爵 台 譲 を 選 択 す る ため に聾 昧的 にき わめ て 有用 であ るこ とが はじ めて 薩忍 され た。
口 頭 発 表 に 際 し 、 紐 川 教 授 か ら 正 常 の 子 宮 内 膜 と 子 宮 体 癌 組 織 と を 比 較 し た 毒 轟 ，PCNA陽 性率 の 鑒 床 応 用 に つ し ヽ て ，PCNA陽 性 ・陰 性ヨ 走例 の浸 潤率 ， 転移 率に つい て， また 正常 内膜 組簸 でPG NAg難 を 示 し た 間 質 細 胞 の 種 類 に つ い て ， 葛 巻 教 授 か ら は 酵 素 抗 体 法 の 染 色 のintensityに つ い て ，in situ hybridizationに よ るmRNAレ ベ ル あ る い は 細 胞 周 期 で の 検 討 に つ い て ， ま たPCN Aの 影 響 化 で のD NA p01y蘭rase−6の ミ ス マ ッ チ り ベ ア に っ い て ， 本 間 教 授 か ら はPCNA陽 性 率 の意 味す なわ ち細 脆旧 期の 短縮 ある いは 蛋白 発纏 の ±曽 加の どち らに 関連 する のかなどについ て質間 が あ っ た 。 さ ら に 小 野 江 教 授 か ら は 転 移 とPCNA陽 性 率 と の 関 係 ，PCNA以 外 の 転 移 関 連 マ ー カ ー な ど に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 こ れ ら の 質 間 に 対 し て ， 申 請 者 は 祇 わ 適 切 に 解 答 し え た 。 発 表 後 ， ． 副 査 の 葛 巻 教 授 ， 本 間教 授に は口 頭試 問に よ ろ審 査を 個別 にう け合 格と 判定 され た。
以 上 ， 本 研 究 は 子 宮 体 癌 に お け るPCNAの 臨 床 上 の 意 義 を 病 理 組 織 学 的 因 子 な ら び に 予 後と の関 連 から はじ めて 明ら かに しえ た研 究で あり ，今 後 の子 宮体 癌の 治療 に役 立っ ものと判断され た。よっ て ，博 士（ 医学 ）の 授与 に値 する もの と判 定さ れ た。
− 99―
