博 士 （ 医 学 ） 穏 騨 一 利
学 位 論 文 題 名
発 育 ラ ッ ト 脳 の 水 素 お よ び 燐 31 の 磁 気 共 鳴 ス ペ ク ト ロ ス コ ピ ー
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
1．研 究目的
脳 の発育 は， 神経細 胞及び 神経膠細胞の増殖，移動，そして分化といった段階に分けられるが，
ラ ットの 脳は人 間のそ れと 比較し てかな り未熟 な状 態で生 まれ， 生後に 神経細胞の分化及び神経 膠 細胞が 起こっ ている 。こ れら脳 での形 態変化 は同 時に劇 的な質 的変化 ，すなわち生化学的変化 を 伴って いる。 本研究 は， 著明な 質的変 化が起 こる 新生児 期のラ ットの 脳を材料に，生後28日ま で の 脳 の 成熟 の 生 化 学 的変 化 を ，1Hお よ び31Pスペク トロピ ーを 用いて ，工ネ ルギー 代謝， 燐 脂 質 の 代 謝， 脳 内pH，脳内 各種ア ミノ酸 の変 化を無 侵襲的 に，か つ系統 的に 解明す ること を目 的 として 行われ た。
1｜ ，方 法 1． 動物モ デル
Sprague−Dawleyラッ ト の 雌 （ 生後14←24週 ）を 生殖可 能な雄 と交 尾させ ，腔ス メアに て精 子が陽 性な のを確 認した 上で， 雄より分離，飼育し，自然出産させた仔を使用した。発達によ＾る 脳 の変 化 を み る ため ， 生 後1，4，7，10，14，18，22，28日 目 の （各5匹 ）計40匹を用 いた。
母親， 仔ラ ット共に固定食，水共に自由に飲食させ，飼育した。測定の際は，Ketamine hydrochlo‑
ride50mg/kg腹腔 内 投 与 に て麻 酔 し た 上 で，NMRプ ロー べ に 設 置 した 。な お生後10日以 降の仔 にっい ては ，脳以 外の信 号の混 入を防ぐために，．頭皮と―部側頭筋を剥離して，実験に用いた。
2． MR spectroscopy
使 用 機 種 は ，Nicolet社 製NMRシ ス テ ムNTF―200（ 静 磁 場 強 度4．7Tesla)で ある 。 ス ペ ク ト口 ス コ ピ ー のコ イ ル と し て ，テ フ 口 ン 防 水し た14Gaugeの 銅線 に て 作 成 した8X12mmの 楕 円 形の 自 家 製 表 面コ イ ル を 用 い ，1Hと31Pの 両 方 に 同調 可 能 の ス イッ チ コ イ ル を使 用 し た 。 a）1H 1331―2662composite pulseに よ り 水及 び脂肪 の信号 抑制 を行い ，spectraを得 た。
1331pulseと2662pulseの間には68msecのエコー時間をおいた。繰り返し時間は2．5秒，掃引幅 は2000Hz，データポイン卜数は4K(4096)，加算回数は512回とした。信号の初期成分に残存 する 強い水 および 脂肪の 信号を 抑制す るために，正弦関数のwind owを掛け，この信号を Fourier変換して周波数領域の信号を得た。
b）31PHspectroscopyが 終 了 し た と こ ろ で ， 次 に コ イ ル を31Pに 同調 し ，31Pの spectraをlpulse sequenceにより測定した。励起パルス幅は20〃，掃引幅は6000Hz，デ一 夕ポイント数は4K (4096)とした。得られた自由滅衰信号に雑音フアル夕―として30Hz の 指 数 関数 を か け ，F ou ricr交 換 し， 位 相 補正を 行い，31Pのspectraを 得た。
III．結 果
新生児ラット脳のIn vivoの1Hのspectraの化学シフトでは，テトラメチルシランを基準（O ppm)と し て，2．02ppmにN―Acetyl―aspartate（NAA），3．04ppmにCreatine，3．21 ppmにCholineの 各 ピ ー ク を 認め た 。 ま た31Pで はPhosphocreatine（PCr)を 基 準（O ppm） と す る が ，6．79 ppmにPhophomonoester（PME)，5．05ppm前 後 にInorganic phosphate（Pi)，2．6ppmにPhophodiesterくPDE)， ー2．54ppmにァ ―ATP， ―7．59 ppmにd一ATP， ←16. 44ppmに ロ‑ ATPの 各 ピ ー ク を 同 定 し た 。 生 後1日 目 の1Hの specctraではNAAが非 常に低く ，Cholineが 高かっ た。ま た3．47ppmの位置にTaurineに よると考えられるピークが認められた。
31PのspectraではPMEの ピ―ク が高く ，PCrのピ ークは まだ低 い所見 がえられた。生後 4日 目 で は1Hのspectraで，NAAの ピー クが上 昇し，Taurineのピー クは同 定不能 となっ た。 生後7日 目ではCholineのピークがCreatineと同レベルとなっており，31Pのspectraで はPCrが やや上 昇して きている。生後10日後ではNAAの急激な上昇がみられた。生後14，18 日で はCholineのピ ークが かなり 減少し ，NAAの一層の上昇がみられる。またPCrが上昇し てい る。生後22，28日 ではCholineのピークは非常に減少しNAAのピークはCreatineよりか な り 高 く な っ て い る 。 ま たPCrが 上 昇 し ，PMEの 減 少 が 著 明 と な っ た 。 発育 の時期 によっ ても脳の 細胞内ATPのレ ベルは不変であると言う多くの報告よルロ−
ATPを 指標(ratioの分 母）と して，Phophocreatine (PCr)，Phosphomonester（PME），
無機 燐(Pi)，pHの 変化， さらにNAA，Cholineの 脳の成熟に伴う変化をまとめると，PCr／ ロ‑ ATPは生後28日聞直線状に増加を示し，一次回帰直線による解析でも明らかな相関係数
を認め，相関係数はO． 99であった。PMEは生下時に高く，生後およそ10日後にピークを示し，
その後滅少している。NAAは生下時には低く，その後著しく増加し，生後28日後にはおおよそ プラトーに達した。Cholineは生下時には高く，生後7日後そして20日後と2段階で減少してい た。Taurineは生後1日目のみ認められたが，その後は認められなかった。なお生後の脳の成 熟 に 伴 う 脳 内 の pHの 変 化 な ら び にPiの レ ベ ル の 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。
IV.考 案
本 研究 ではIn vivolH，31PのspectroscopyによりPCr，NAAが生下時には低く ，その後 発達と共に増加すること。Choline，Taurineは逆に生下時には高く，その後滅少していくこと。
PMEは生後10日頃にピー クを示すこと。また、pH，Piなどは新生児期のmaturationでは変 化しない等がわかった。ラット脳の形態的発達は4っの時期にわけることができる。すなわち，
第1期は（出生前）は神経細胞の増加がみられ，第2期（生後1日から10日）は軸索の成長と樹 状突起の増加がみられ，第3期（生後10日から20日）では急速な髄鞘形成，そして第4期（生後 20日から30日）は緩徐な髄鞘形成がみられる最終成熟期と言われている。本研究でみられる物質 の変化は，これら発達の時期を反映していると言える。
生後の発達期に於いて自由工 ネルギーの基本単位であるATPは一定レベルを示すと言われ る 。それとは対照的に，PCrは日令と直線的増加をしめした（相関係数0．99)。PCrの脳の成 熟に伴う増加は，神経運動の増加によるエネルギー消費の増大を反映していると思われる。燐脂 質は全脳の脂質の60％以上を占める腫瘍成分であり，細胞膜の構成に関与している。その燐脂質 の 前 駆体 にあ たる のがPMEであり，Phosphoethanolamine，Phosphocholineに代 表される が，本研究に於いても，PMEは生後10日目に最も高く，これは脳細胞の増殖が細大となる時期 と よく一致している。NAAは成熟した哺乳動物のなかで2番目に多いアミノ酸であるにもかか わらず，脳での役割は依然として不明である。しかしながらその急激に増加する時期が脳内の髄 鞘形成の盛んな時期と一致することから，NAAのアセチル化した物が，脂肪酸の生合成の原料 と して，発育する脳の髄鞘形成 に於いて重要な役割を果た している可能性が示唆される。
VI．結 論
新生児の ラットの生後28日までの脳の成熟の生化学的変化を1Hおよび31Pスペクト口スコ ピ ー を 用 い て ， 経 時 的 に 観 察 す る こ と に よ り ， 次 の 結 論 を 得 た 。 1）PCr7ロ―ATPは生後28日間直線状 に増加を示した（相関値二二O．99)。PME/ロ・ATP
は生下時に高く，生 後およそ10日後にピークを示 し，その後滅少していた。2)脳内pH及び Piのレベルは生後28日間では変化はなかった。3）NAAは生下時には低く，その後増加し，
生後28日後におおよそプラ卜―に達していた。4）Cholineは生下時には高く，生後7日後そし て20日後と2段階で減 少していた。5）Taurineは 生後1日目のみ認められたが，その後は認 められなかった。
学位論文審査の要旨
脳の発育は，神経細胞及び神経膠細胞の増殖，移動，そして分化といった段階に分けられる。
ラットでは生後速やかに神経細胞の分化および神経膠細胞の増殖，分化がおこっている。本研究 は，急速に質的変化が起こる新生児期のラッ卜の脳を材料に，生後28日までの脳の成熟の生化学 的変化を，1Hおよび31Pスペクト口スコピーを用いて，工ネルギー代謝，燐脂質の代謝，脳内 pH，脳内各種アミノ酸の変化を非侵襲的に，系統的に解析した。
新生児期のラッ卜脳のIn vivoの1Hの化学シフトでは，テトラメチルシランを基準として2． 02ppmにN亠acetyl―aspartate (NAA） ，3．04ppmにCreatine，3．21ppmにCholineの 各 ピ ー ク を 認 め た 。 ま た31Pで はPhosphocreatine（PCr)を 基 準と して ，6．79ppmに Phosphomonoester (PNE），5，05ppm前後に無機燐(Pi)，2．6ppmにPhosphodiester，―
2． 54ppmに7―ATP，−7．59ppmにd―ATP，‑ 16. 44ppmに ローATPの各 ピー クを 同 定 し た。 生後1日 目の1Hで はNAAが 非常 に 低く ，Cholineが高かった。また3．47ppmの位置 にTaurineによ ると 考え られ るピークが認められた 。31PではPMEのピークが高 く，PCrの ピークはまだ低 い所見がえられた。生後4日 目では1Hで，NAAのピークが上昇し，Tau rine のピークは同定 不能となった。生後7日目ではCholineのピークがCreatineと同レベルとなっ て おり，31PではPCrが やや上昇してきている。生後10日後ではNAAの急激な上昇 がみられ た。生後14，18日ではCholineのピークがか なり減少し，NAAの一層の上昇がみられた。ま たPCrの上昇がみられた 。生後22，28日ではCholineのピークは非常に減少しNAAのピーク
弘雄 厚 輝和 部橋 部 阿石 阿 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
はCholineよ り か な り 高 く な って い た 。 ま た31Pで はPCrが 上 昇 し，PMEの減 少 が 著 明 であ っ た 。p―ATPを 指 標(ratioの 分 母 ） と し てPhophocreatine (PCr)，Phosーphomonoester
（PME)， 無 機燐(Pi，pHの 変 化 ， さら にNAA，Cholineの 脳 の成 熟 に 伴 う 変化 を ま と め ると ， PCr/ロ‑ ATPは 生 後28日 間 直 線 状 に 増 加 を 示 し ， 一 次回 帰 直 線 に よる 解 析 で も ， 明か な 相 関 係 数を 認 め ， 相 関係 数 はO．99であ った 。PMEは生下 時に高 く，生 後お よそ10日 後にピ ーク を 示 し ， そ の 後 減 少 し て い た 。脳 内pHお よびPiの レベ ル は 生 後28日 間 で は 変化 は な か っ た 。 NAAは 生 下 時 に は低 く ， そ の 後著 し く 増 加 し， 生 後28日後 に は お お よそ プ ラ ト ー に達 し た 。 Cholineは生 下 時 に は 高く ， 生 後7日後 そ し て20日 後 と2段 階で 減 少 し て いた 。Tau rineは 生 後1日目 のみ認 められ たが， その 後は認 められ なかっ た。
ラッ ト 脳 の 形 態的 発 達は4っ の時期 にわ けるこ とがで きる。 すなわ ち， 第1期 は（ 出生前 ）は 神経 細胞の 増加が みら れ，第2期 （生後1日 から10日 ）は軸 索の 成長と 樹状突起の増加がみられ，
第3期（ 生 後10日か ら20日 ）では 急速 な髄鞘 形成， そして 第4期（生 後20日 から30日 ）は 緩徐な 髄鞘 形成が みられ る最 終成熟 期と言 われて いる。 本研 究でみ られる 物質の 変化は，これら発達の 時期 を反映 してい ると 言える 。
生後 の 発 達 期 に於 い て 自 由 工ネ ル ギ ― の 基本 単位 であるATPは 一定レ ベルを 示す と言わ れて い る 。そ れ と は 対 照的 に ，PCrは 日 令 と 直 線的 増 加 を し めし た （ 相 関係 数0．99)。このPCrの 脳の 成熟に 伴う増 加は ，神経 活動の増加によるエネルギー消費の増大を反映していると思われる。
燐脂 質は全 脳の 脂質の60％以上 を占 める主 要成分 であり ，細 胞膜の 構成に関与している。その 燐 脂 質 の 前 駆 体 に あ た る の がPMEで あ り ，Phophoethanolamine，Phophocholineに代 表 さ れ る 。本 研 究 に 於 いて も ，PMEは 生 後10日目 に 最も 高く， これは 神経細 胞及び 神経 膠細胞 の増 殖が 細大と なる時 期と よく一 致して いた。
NAAは 成 熟し た 哺 乳 動 物に な か で2番目 に 多 い ア ミ ノ酸 で あ る に もか かわら ず，脳 での役 割 は依 然とし て不明 であ る。し かしな がらそ の急激 に増 加する 時期が 脳内の 髄鞘形成の贐んな時期 と 一 致す る こ と か ら，NAAの アセ チ ル 化 し た物 が， 脂肪酸 の生 合成の 原料と して， 発育 する脳 の髄 鞘形成 に於い て重 要な役 割を果 たして いる可 能性 が示唆 された 。
口頭 発 表 の 審 査会 に お い て ，阿 部 和 厚 教 授よ り1H及 び31Pスペク ト口 スコピ ーの各 ピーク と そ の 絶 対 値 と の 関 係 ， ま た ラッ ト 脳 で の 髄鞘 形 成 とN―acetyl―aspartate (NAA)の ピ ー ク の 関 係 ， さ ら にPhosphocreatine，ATPなど の 高 工 ネ ルギ 一 燐 酸 化 合 物と ラ ッ ト の 脳の 発 達 に っ い て の 質 問 が な さ れ た 。ま た 石 橋 輝 雄教 授 よ り ， ロ・ATPが31Pの 各 ピー ク （ す な わ ち PME，Pi，PCr)と の 比 の 分 母 と し て 適 当 か ， 燐 脂 質 の 前 駆体 とPME，Cholineの 関 係に っ い
て ，31Pス ペク ト口 ス コピーでのPCrと1Hスペク ト口スコピーでのCrの関係に っいて質問 がなさ れた。さらに藤本征一郎教授より，ラットの脳代謝にたいする麻酔薬の影響，MRスペ クト口スコピ一検査時の周囲の温度，発育ラットの栄養にっいて質問がなされた。最後に，寺沢 浩一教授より臨床に於ける研究の可能性にっいて質問がなされた。これらにっいて，申請者は概 ね適切な回答を行った。
本研究は発育ラット脳に於いて水素及び燐31の磁気共鳴スペクト口スコピ―を用いて，各種ア ミノ酸 等の変化を明らかにしたものであり，有意義な研究と考えられ，学位授与に値する。
