博士（医学）石黒信久 学位論文題名
A RAT MODEL OF HTLV ‑ IINFECTION I. Humoral antibody response, provirus integration and HAM/TSP like myelopathy in seronegative HTLV ‑ I carrier rats
（ ヒト T 細 胞 白 血病 ウ イ ル ス 感染ラ ットモ デル I ．抗 HTLV −I 液 性抗体 反応， プロウ イルス ゲノ ムの 臓 器 分 布 ， 抗 体 陰 性 持 続 感 染 ラ ッ ト に お け る HAM/TSP 様病 変の 発症）
学位論文内容の要旨
I．はじめに
HumanTlymphotropic virus typeI（HTLV―I）は1980年 に初め てヒ卜 から分 離同定 さ れ た レト 口ウイ ルスの 一種で ，成人T細胞自 血病（ATL)のみな らず慢 性進行 性の脊 髄症 HAM/TSPや関節 症HAAPの原 因ウイ ルスと しても 注目さ れてい るが， その疾 患発症機 序は 未だ明らかではない。これらの機序解明の為にはHTLV ‑I関連疾患発症モデル動物の開発が 長 らく待 たれてき た。本 研究で は，HTLV ‑I持続感 染ラッ 卜を作 製して，抗HTLV・I抗体 価の変動，HTLV―Iプ口ウイルスゲノムの分布にっいて検討し，さらに臨床的，神経病理学的 に ヒトのHAM/TSPに極め て類似 する脊 髄病変 を有する疾患モデル動物の作製に成功したの で報告する。
n. 材料と方法
1 ） 細 胞 株： 4 種 の 近交 系 ラ ット (LEW/Hkm ， WKAH/Hkm ，F344/Slc ，ACI/Hkm ） の脾細胞とATL 患者より採取したATL 細胞とを混合培養して 4 種類の HTLV ・I 不死化ラッ ト T 細胞株（LEW ―si ，WKA ―Sl ，F344 ―si ， ACI ―si ）を得た。HTLV ‑I 不死化ヒトT 細胞株として MT ―2 を用いた。
2 ） 動 物 及び HTLV − I 感染ラ ットの 作製：7 種の近 交系ラ ッ卜(LEW/Hkm ， WKAH7
Hkm，F3447Slc，ACI7Hkm，SDJ/Hkm，BUF7Hkm，LE J/Hkm） は 北 海 道 大 学 医 学 部 付 属 動 物 実 験 施 設 及 びSLC Japan（ 静 岡） か ら 供 給 を受 け ， 以 下 の 如くHTLV―I感 染 ラ ッ ト を 作 製 し た 。(a)マ イ ト マ イ シ ンCで 処 理 し たLEW―Si，WKA・si細 胞 （lx10T／ 頭 ） を 各 々 生 後24時 間 以 内 のLEW/Hkm，WKAH/Hkm系 新 生 仔 ラ ッ ト の 腹 腔 内 に 接 種 し た 。 （b） MT−2細 胞 （lx10 ／ 頭 ） を 生 後24時 間 以 内 の ．LE W/Hkm，WKAH/Hkm，F3447Slc， ACI/Hkm系 新 生 仔 ラ ッ ト の 腹 腔 内 に 接 種 し た 。(c)16週 令 のLEW/Hkm，WKAH/Hkm，F 344/Slc，ACI7Hkm，SDJ/Hkm， BUF7Hkm，LEJ/Hkmラ ッ ト の 尾 静 脈 よ りMT―2 細胞 （lx10 ／頭） を2週間隔 をおい て2回静脈 内接 種した 。
3） 抗 体 価 の 測 定 ： 血 清 及 び 髄 液 中 の 抗HTLV―I抗 体 価 は ゼ ラ チ ン 凝 集 法(SERO‑
DIA． HTLV―I，Fuji Rebio)を 用いて 測定し た。
4）PCR法 に よ るHTLV・Iプ ロ ウ イ ル ス ゲ ノ ム の 検 出 ： 末 梢 単 核 球お よ び 各 実 質 臓器 よ り ProteinaseK＆SDS法 を 用 い て 抽 出 し たDNAを 鋳 型 と し て ，HTLV亠Iのpol領 域 及 びpX 領 域 に 特異 的 な 塩 基 配列 を 増 幅 するプ ライ マーを 用い， 変性94℃1分 ，ア ニーリ ング58℃2分 ， 合 成72℃2分 を1サ イ ク ル と し たPCR法 に よ り35回 増 幅 を 行 っ た 。 増 幅 さ れ たDNAを2％ ア ガ口 ースゲ ルに 泳動後 ，゛ナ イ口ン 膜にト ランスファーし，3 P標識した塩基配列特異的オリゴヌ クレ オチド プロ ーブと ハイブ リダイ ゼーシ ョン して， 洗浄後 オート ラジ オグラ フィーを行った。
pol及 びpX各 々の 領 域 の プ ライ マ 一 及 び プ口 ー ブ で プ 口ウ イルス ゲノム が検出 され た検体 を陽 性と 判定し た。
5） 光 学 顕微 鏡的観 察：ヘ マト キシリ ン＆エ オジン 染色の 他に 必要に 応じて ルクソ ール ・ファ ス ト ・ ブ ル ー 染 色 ， ボ デ ィ ア ン 染 色 及 び ホ ル ツ ァ ― 染 色 を 用 い て 標 本 を 観 察 し た 。
m． 結 果
1）4種 類 のHTLV―I不 死 化 ラ ッ トT細 胞 株 （LEW―si，WKA―si，F344―Si， ACI―Si） に っ い て ， 各 々 のHTLV―Iプ ロ ウ イ ル ス ゲ ノ ム の 組 み 込 み ，mRNAの 発 現 及 び ウ イ ル ス蛋 白 の 産 生 を各 々 サザン ブロッ ト法 ，ノザ ンブロ ット法 及びウ ェス タンブ 口ッ卜 法に よ っ て 確認 し た 。
2）HTLV・I感 染 ラ ッ ト 作 製 ： 末 梢 単 核 球 よ り 抽 出 し たDNAを 用 い てPCR法 を 行 い 感 染 の 有 無 を 判 定 し た 。(a) LEW・siあ る い はWKA・si細 胞 を 接 種 さ れ たLE W/Hkm， WKAH7Hkm系 新 生 仔 ラ ッ ト で は 各 々18頭 中16頭 ，3頭 中3頭 に 感 染 が 成 立 し た 。(b)MT ‑ 2細 胞 を 接 種 さ れ たLE W/Hkm，WKAH7Hkm，F344/Slc，ACI/Hkm系 新 生 仔 ラ ッ ト
に お い て は ， 各 々8頭 中8頭 ，9頭 中8頭 ，20頭 中16頭 ，8頭 中7頭 に感 染が 成 立し た。(c)MT ‑ 2細 胞 を 接 種 さ れ た LE W/Hkm， WKAH/Hkm，F3447Slc，ACI7Hkm，SDJ7Hkm， BUF/Hkm，LEJ7Hkm系 成 熟 ラ ッ ト で は 各 系 統5頭 中5頭 全 て に プ ロ ウ イ ル ス ゲ ノ ム が 検 出 さ れた 。以 上 ，接 種す る 細胞 の種類，接種 時期及びラットの 系統による感染率の 差異は見い出 せ な かっ た。
3） 各 種 系 統 ラ ッ ト 間 に お け るHTLV−Iに 対 す る 液 性 抗 体 反 応 ：MT・2細 胞 を2回 静 脈 内 接種 さ れた 上記2）− （c)群 の7系 統の 各 ラッ トよ り 初回 接種 後2，3，7，13，21，28，40及 び49週 目 に 採 血 を 行 い ， 抗HTLV−I抗 体 価 を 測 定 し た 。 抗 体 価 は 接 種 後2〜3週 目 よ り 検 出 さ れ （1:8―1：8192)，12週 目 に は プ ラ ト ー に 達 し ，49週 目に 至っ て も比 較的 高 値に 維持 さ れ て い た 。 抗 体 価 の 高 低 に よ り ， 各 種 系 統 ラ ッ ト は3群 に 分 類 さ れ た 。F 344／Slc，SCI/
Hkm，SDJ/Hkm（ 高 反 応 群 ） ；WKAH/Hkm，BUF/Hkm，LEJ/Hkm（ 中 間 反 応 群 ） ； LE W/Hkm（低 反 応群 ）。
4) HTLV−Iプ 口 ウ イ ル ス ゲ ノ ム の 臓 器 分 布 ： 新 生 児 期 にMT―2を 接 種 さ れ たF344/Slc ラ ット 内5頭 を 生後50週 目 に屠 殺し て 各臓 器に お ける プ口 ウ イル スゲ ノ ムの 分布 を 検索 した と こ ろ ，個 体間 の 差は 存在 す るも のの検索した 全ての臓器（大脳 ，小脳，胸腺，心臓 ，肺，肝臓，
腎 臓 ，脾 臓， 顎 下腺 ，リ ン パ節 ，末 梢 単核 球） よ り検 出さ れ た。
5） HA M/TSP様 病 変 （HAMラ ッ ト ） の 発 症 ： 新 生 時 期 にMT―2を 接 種 し て キ ャ リ ア 化 し たWKAH／Hkmラ ッ ト8頭 中3頭 を1年 以 上 に わ た り 観 察 し た 。 こ れ ら3頭 全 て は 生 後 16〜 18か月 時 に後 脚の 進 行性 痙性麻痺症状 を呈し，3頭中2頭 を解剖し得た。組織 学的には胸髄 を 中 心と した 前 索及 び側 索 にお ける左右対称 性の広汎な自質変 性像（脱髄，空胞変 性，グリオー シ ス 及び マク ロ ファ ージ の 浸潤 等）を認めた 。リンパ球浸潤は ほとんど存在せず， 灰白質はよく 保 た れ て い た 。 病 変 は ヒ トHAM/TSPに 極 め て 近 い と 考 え ら れ た 。 血 清 及 び 髄 液 中 よ り 抗 HTLV・I抗 体 価 は 検 出 さ れ な か っ た 。 大 脳 ， 脊 髄 及 び 全 身 各 臓 器 よ り 抽 出 し たDNAよ り HTLV ‑Iプ 口 ウ イ ル ス ゲ ノ ム が 検 出 さ れ た 。WKAH/Hkm以 外 の 系 統 にHAM/TSP様 病
変は見い出せなかった。
IV.考 案
1） ヒ ト に お い て 特 定 のHLA haplotypeを 持 つHTLV−Iキ ャ リ ア ー にHAM発 症 が 多 い と す る 報 告 が あ る が ， ラ ッ ト に お い て もWKAH/Hkm系 に の み そ の 発 症 を み た こ と か ら ラ ッ トMHC（ 特 にRT1＾haplotype)を 含 め た 遺 伝 的 素 因 がHAM/TSP様 病 変 発 症 に 関 与 し て
いる可能性があると推定された。
2)ヒ トHA M/TSPで は 髄液 中の 高力 価 の抗HTLV−I抗体 の存 在， 病 変部 位に おけ るり ンパ球浸潤 の存在等によりHAM発症に免 疫学的機序の存在が推定されているが仔細は不明の ままである 。今回作製したHAMラットで はこれらの所見が欠如しており，病変形成には免疫 学的機序ではなくウイルスの直接侵襲が関与してい．る可能性がある。今後，HAMラットの検体 を用いてin situ hybridization等を行い脊髄内におけるウイルスの局在部位を明らかにする事 により解明されていくものと期待される。
3） 今回 開発 したHAMラッ トモ デ ルは ヒトHA M/TSPの 発症 機序 の解 明の 上で極 めて有 カなモデル系と考えられた。さらに多発性硬化症をはじめとするヒト神経難病の病因を探る上で 重要な手掛かりを与えてくれるものと考えられた。
V.結 語
1) HTLV・I感 染 ラ ッ トT細 胞 株 及 ひ ヒ 卜 由 来 のHTLV・I感 染T細 胞 株MT―2を 接 種 す る こ と に よ り7系 統 の 近 交 系 ラ ッ ト に HTLV・ I特 続 感 染 が 成 立 し た 。 2)7種の近 交系ラッ、トにっいてHTLV・Iに対する液性免疫応答性 を検討したところ，高 応答群，中間応答群，低応答群の3群に大別された。
3) HTLV―I感 染 ラッ トで は中 枢 神経 系を 含め てほ とんど全ての臓器においてHTLV−I 遺伝子の存在を認めた。
4） 新 生 時 期 にMT−2を 接 種 し てHTLV ‑Iに 感 染 し たWKAH/Hkmラ ッ ト に16か ら18 か月の潜伏 期を経て臨床的，神経病理学 的にヒトのHA M/TSPに極め て類似する脊髄病変が 形成された。
学位論文審査の要旨
HumanTlymphotropic virus typeI(HTLVーI） は ， 成 人T細 胞 自 血 病(ATL)の み な
三 敬
暹
脩
本 木
巻
松 吉
葛
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
ら ず ， 最 近は 慢性 進 行性 の脊 髄症HAM/TSPや関 節 症HAAPの 原因 ウ イル スと して も注 目 されているが，それらの疾患の発症機序は未だ明らかではない。HTLV ‑I関連疾患発症モデル 動 物 を 作 製 し て こ れ ら の 機 序 解 明 に 資 す る こ と を 目 的 と し て 本 研 究 は 行 わ れ た 。
ま ず4種 の 近 交 系 ラ ッ ト （LEW/Hkm, WKAH7Hkm, F344/Slc，ACI/Hkm） の 脾 細 胞 とATL患 者 よ り 採 取 したATL細胞 とを 混 合培 養し て4種類 のHTLV・I不 死化 ラッ トT細 胞 株 （LEW―si, WKA―si，F344―si，ACI―Sl）を 得 た。 ヒト のHTLV−I不 死化T細 胞 株 と し て はMT2が 用 い ら れ た 。 さ ら に7種 の 近 交 系 ラ ッ ト （LEW7Hkm，WKAH/Hkm， F3447Slc，ACI/Hkm，SDJ7Hkm，BUF/Hkm, LEJ/Hkm） を 用 い て っ ぎ の 方 法 で HTLV―I感染 ラッ トを 作製 し た。(a)マイ トマ イシ ンCで処理したLEW−Sl，WKA―si細胞 を各々生後24時間以内の同 系新生仔ラットの腹腔内へ ，(b)MT・2細胞を生後24時間以内の LEW7Hkm, WKAH/Hkm，F344/Slc, ACI7Hkm系 新 生 仔 ラ ッ 卜 の 腹 腔 内 へ ，(c)16週 令の7種の近交系ラットの 尾静脈よりMT・2細胞を2週間 隔をおいて2回静脈内接種。血清及 び髄 液中 の抗HTLV―I抗体 価 の測定はゼラ チン凝集法を用いて行われ た。HTLV ‑Iプロウ イルスゲノムの検出は，末 梢単核球及び各実質臓器よ りProteinaseK＆SDS法を用いて抽出 し たDNAを 鋳 型 と し てHTLV，Iのpol領 域及 びpx領域 に 特異 的な 塩基 配 列を 増幅 する プ ライマーを用いPCR法で行 われた。増幅されたDNAをナ イ口ン膜にトランスファーし，3゜P 標識した塩基配列特異的オリゴヌクレオチドプ口一ブとハイブリダイズして，洗浄後オートラジ オグラフィーを行っている。光学顕微鏡ではへマトキシリン＆工オジン染色の他に必要に応じて ルク ソー ル・ フ ァス ト・ ブル ー染色，ボ ディアン染色及びホルツアー 染色で観察した。
以上により， 以下の結果が得られた。
1）HTLV・I感 染 ラ ッ トT細 胞 株 及 び ヒ ト 由 来 のHTLV・I感 染T細 胞 株MT・2を 接 種 す ることにより7系 統の近交系ラットにHTLV・I持続感染が成立した。ラットの系統，接種時 期及び接種方法 による感染率の差異は認めら れなかった。
2）7種の 近交系ラットにっいてHTLV・Iに対する液性免疫応答性を 検討したところ，高応 答群，中間応答 群，低応答群の3群に大別さ れた。
3）HTLV―I感染 ラッ ト では 中枢 神経 系を 含 めて ほとんど全ての 臓器においてHTLV―I遺 伝子の存在を認 めた。
4） 新 生 児 期 にMTー2を 接 種 し てHTLV←Iに 感 染 し たWKAH/Hkmラ ッ ト に16か ら18か
月 の潜伏期を経て臨床的，神 経病理学的にヒトのHAM/TSPに極めて類似する脊髄病変が形 成 された。
口頭 発表 の後 ，吉 木 ，葛 巻， 長嶋 各 教授 から ヒト のHAM/TSPと ラ ットHAMの病態 所見 の類似点と相違点，seropositive adult carrierで．のラットHAM発症はありやなどに関し，多 数の質問が寄せられ，討議が行われたが，申請者からは何れに関しても極めて順当かっ正確な答 えがなされたものと判断された。
この 研究 で開 発さ れ たHAMラ ット モデ ルは ヒトHAM/TSPの 発症 機序 の解明の上で 有カ なモデル系にな りうるものである。今後この系を通じてHAMラットの病変発症機序を解明し てゆく事により多発性硬化症をはじめとするヒト神経難病の病因を探る上で重要な手がかりが得 られる可能性があり，本論文はその意味で学位論文として十分に価値あるものと判断された。
