博士（医学）金 木蘭 学位論文題名
ラット卵巣におけ．るマト1J ックスメタロプロテアーゼ―23 (MMP‑23) の 発現 調 節 機 序の 解 析
学 位 論 文内 容 の 要 旨
［背景と目的］雌性生殖器官は，性周期や妊娠・分娩過程に伴い周期的な細胞外マトリック ス(ECM)の 再 構 築 が 観 察 さ れ る ユ ニ ー ク な 器 官 で あ る ． こ のECMの 分解 に関 わる マ 卜リ ック スメ タロプ 口テアーゼ(MMP)の役割につ いて解析を進める過程で，雌性生殖器 官に 特異 的に 発現 する 新規 のラ ットMMP (Rat ortholog of MMP‑23) cDNAク□ーニン グに 成功 した ，MMP‑23はシステインスイッチを保持せず，N末端に膜貫通構造を持つ点 にお いて 他のMMPファミリ―と大きく異なる構造 的特徴を有している．また基質に対す る分解活性が弱いことから，新しい機能を有する可能性が考えられる．本研究ではラッ卜 卵巣 細胞 の初 代培 養系 を確 立し ，そ れら を用い てゴナドト口ピンによるMMP‑23の発現 調節機序を解析した．
［対象と方法］実験には，生後21日の幼若，雌，SDラットを用いた．in situ hybridization 法に より ，ラ ット 雌性 生殖 器に おけ るMMP‑23の 発現部位を同定した．ラット卵巣細胞 にお けるMMP‑23の 発現 機構 を解 明す るた めに， ラッ卜顆粒膜細胞および莢膜・問質細 胞の初代培養細胞系を確立し，調製した初代培養細胞にゴナドト口ピン刺激を与えたとこ ろ経 時的 にス テ口 イド ホル モン およ びcAMPを産 生することが確認された．又経時的に MMP‑23 mRNA量の変動をRT‑PCR法により定量した．
［結 果］ ラッ 卜卵 巣に おけ るMMP‑23の発 現は 原始 卵 胞か ら2次卵 胞初 期まで顆粒膜細 胞に限局しており，排卵に向けて卵胞が成熟するに従い，顆粒膜細胞での発現が減少し，
代わりに外莢膜細胞層に特異的な発現が見られること をわsitu hybridization法により 明らかにした，ラッ卜顆粒膜細胞および莢膜・問質細胞の初代培養細胞系を確立した．調 製した初代培養細胞は，いずれもゴナドト口ピン刺激特異的なステ口イドホルモンおよび cAMPを産 生し たこ とか ら， ゴナ ドト 口ピ ン受容 体を介した細胞内情報伝達系が機能し ていることが確認された．これらの細胞にゴナド卜ロ ビン刺激を与え，経時的なMMP‑23 mRNA量 の 変 動 をRT‑PCR法 に よ り 定 量 し た 結 果 ，MMP‑23の 発 現 は 顆 粒 膜 細 胞 で は 経 時 的 に 減 少 す る が ， 莢 膜 ・ 問 質 細 胞 で は 経 時 的 に 増 加 す る こ と が 判 明 し た ．
［考察】ラット卵巣におけるMMP‑23の発現部位を而situ hybridization法により検討し た結果、MMP‑23が初期の卵胞において顆粒膜細胞層で 機能し，排卵直前の成熟卯胞では そ の 機 能 場 所 が 外 莢 膜 細 胞 層 へ 変 わ る もの と予 想さ れる ．MMP‑23は 既存 のMMP基 質 に対する分解活性が弱いことから，酵素としての機能 はス卜口メライシン3 (MMP‑11)と
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同様に細胞外マトリックスの分解以外にあると予想されるが，特異的な基質は未だ不明で あ る． 卵胞形成 過程に おけるMMP‑23の機能を 解析する 上で， その特異 的な基 質の同定 は必須であり，現在検討中である．
ラッ卜 卵巣の成 熟過程 におけるMMP‑23の局在 の変化 は、卵胞 を構成す る細胞 群にゴ ナ ド卜 口ピン特 異的なMMP‑23の発現 調節機序 が存在す ること を示唆し ている ．調製し た各 初代培養 細胞は ，いずれ もゴナ ドトロピン刺激特異的なステロイドホルモンおよび cAMPを産 生し， ゴナドト ロピン受 容体を介した細胞内情報伝達機序が作用していること を示唆している．また，生理的機能が確認された条件において，各細胞の分化過程におけ るMMP‑23のmRNAを 定 量 し た 結 果 ，MMP‑23の 発 現 は ， 顆 粒 膜 細 胞 で は 分 化 に 伴 い 経時的に減少するが，莢膜・問質細胞では経時的に増加することが判明した，この結果は 面situ hybridization法で得 られたむガVOの結果と相関するものであり，ここで確立し た 初代 細胞培養 系がMMP‑23の 発現調 節機序を 分子レベ ルで解 析する上 で非常 に有用な ものであることを示している．
ま た 顆粒 膜 細 胞に お い てFSH刺激 後24時 間 でMMP‑23の 発 現 抑制 が 観 察さ れ る が，
同 時期 にプロゲ ステロ ン産生が 亢進さ れる現象 に注目す ると，MMP‑23の転写 抑制にプ 口ゲステ□ンが関与している可能性が示唆される．今後，確立した初代培養細胞を用いて，
プ 口ゲ ステロン ならび にプ口ゲ ステロ ン受容体 拮抗剤に よるMMP‑23の 発現に 対する作 用 を検 討し，更 にMMP‑23の転 写調節 領域を解 読し，顆 粒膜細 胞および 莢膜・ 問質細胞 における細胞特異的な調節機序の解明を行う予定である。
［結諭］ ラット 卵巣にお けるMMP‑23 mRNAの発現 は，顆 粒膜細胞では卵胞成熟に伴い減 少し，代 わって 外莢膜細 胞では増加するということがわsitu hybridization法により明 らかとなった．
本研究で確立した顆粒膜細胞および莢膜・問質細胞の初代培養系において，ゴナドト□
ピン刺激に特異的に応答する細胞内情報伝達機構を確認した，
ゴ ナ ドト 口 ピ ンに よ るMMP‑23 mRNAの 変 動を 半 定 量的Multiplex RT‑PCR法 によ り 定 量 し た ． 顆 粒 膜 細 胞 ではFSHによ る 分 化誘 導 に 伴いMMP‑23 mRNAの 経 時 的 減少 が 観察 さ れ ，一 方 莢 膜・ 問 質 細胞 で はLH刺 激 に よる 分化に 応じたmRNAの増加が 確認さ れた．こ れらの 結果より ，ゴナド ト口ピ ンによる 卵胞構 成細胞特 異的なMMP‑23の発現 調節機構が存在することが示唆された，
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授 長 嶋 和郎 副査 教授 細川眞澄男 副査・教授 藤本征一郎
学 位 論 文 題 名
ラット卵巣におけるマトリックスメタロプロテアーゼ―23 (MMP‑23) の発現調節機序の解析
マ ト リ ッ ク ス メ 夕 口 プ 口 テ ア ー ゼ(MMP)の 役 割 に つ い て 解 析 を 進 め る 過 程 で ， 雌 性 生 殖 器 官 に 特 異 的 に 発 現 す る 新 規 の ラ ッ トMMP (Rat ortholog of MMP‑23) cDNAク 口 ー ニ ン グ に 成 功 し た ． 本 研 究 で は ラ ッ ト 卵 巣 細 胞 の 初 代 培 養 系 を 確 立 し ， そ れ ら を 用 い て ゴ ナ ド ト ロ ピ ン に よ るMMP‑23の 発 現 調 節 機 序 を 解 析 し た ．
ラ ッ ト 卵 巣 に お け るMMP‑23の 発 現 は 原 始 卵 胞 か ら2次 卵 胞 初 期 ま で 顆 粒 膜 細 胞 に 限 局 し て お り ， 排 卵 に 向 け て 卵 胞 が 成 熟 す る に 従 い ， 顆 粒 膜 細 胞 で の 発 現 が 減 少 し ， 代 わ り に 外 莢 膜 細 胞 層 に 特 異 的 な 発 現 が 見 ら れ る こ と を むsitu hybridization法 に よ り 明 ら か に し た ． ラ ッ ト 卵 巣 細 胞 の う ち 顆 粒 膜 細 胞 と 莢 膜 ・ 問 質 細 胞 と を 別 々 に 分 け た 初 代 培 養 細 胞 系 を 確 立 し た ． こ れ ら2つ の 初 代 培 養 細 胞 は ， い ず れ も ゴ ナ ド ト 口 ピ ン 刺 激 特 異 的 な ス テ 口 イ ド ホ ル モ ン お よ びcAMPを 産 生 し た こ と か ら ， ゴ ナ ド ト 口 ピ ン 受 容 体 を 介 し た 細 胞 内 情 報 伝 達 系 が 機 能 し て い る こ と が 確 認 さ れ た ． こ れ ら の 細 胞 に ゴ ナ ド ト □ ピ ン 刺 激 を 与 え ， 経 時 的 な MMP‑23 mRNA量 の 変 動 を 半 定 量 的multiplex RT‑PCR法 に よ り 定 量 し た 結 果 ，MMP‑23の 発 現 は 顆 粒 膜 細 胞 で は 経 時 的 に 減 少 す る が ， 莢 膜 ・ 問 質 細 胞 で は 経 時 的 に 増 加 す る こ と が 判 明 し た ． こ れ ら の 結 果 か ら 卵 胞 構 成 細 胞 に は そ れ ぞ れ 特 異 的 なMMP‑23の 発 現 調 節 機 構 が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た ，
公 開 発 表 に 当 り ， 副 査 の 細 川 教 授 よ り ， 半 定 量 的multiplex RT‑PCRに よ るmRNAの 定 量 方 法 の 正 確 性 ， 蛋 白 レ ベ ル の 発 現 と 局 在 ， そ の 機 能 等 に つ い て の 質 問 が あ っ た ，
