博士（獣医学）姚 建勝 学位論文題名
Studies on enhancement and neutralization of hantavirus infection with antibodies in macrophage cell lines
（ マ ク ロ フ ァ ージ 株 化 細 胞 に お け る ハ ン タウ イ ルスの 抗 体 依 存 性感 染 増 強 と 中 和 に 関 する研 究）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
腎 症 候 性 出 血 熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome： HFRS)は 主 にげ つ 歯 類 か ら 人が罹 患し， 高熱 ，出血 傾向及 び腎臓 障害を 起こ す極め て重篤 なウイ ルス 性人獣共通伝染病で あ る。本 病の病 原ウ イルス はブニ ヤウイ ルス科 のハ ンタウ イルス 属に属 し， 現在，由来動物種に 対 応 し た4種 類 の 血 清 型(Apodemus，Rattus，Clethrionomys，Microtus)が あ る 。 こ れまで ドブ ネズミ におけ るハン タウ イルス の感染 調査で は，中 和抗 体価の高い成熟個体から の ウイル ス分離 率が 著しく 高く， 中和抗 体存在 下で の本ウ イルス の持続 感染 の機序を巡って大き な 関心が 寄せら れて いた。 最近， 本ウイ ルスに 対し てマク ロファ ―ジや 単球 の感受性が高く，標 的 細胞の ーっと して 全身的 ナょ感 染の拡大に大きな役割を果すばかりでなく，抗体の存在下ではむ し ろ感染 を増強 する ことも 報告さ れた。 これと 同様 のマク 口ファ ージに おけ る抗体依存性感染増 強(antibody―dependent enhancement of infection： ADE）現 象はデ ング 熱でも 認めら れ，
デ ング出 血熱や デン グショ ック症 候群に みられ る病 勢増悪 の主因 のーっ と考 えられている。従つ て ， ハ ン タ ウ イ ル ス 感 染 に お け るADEの 発 現 は 抗 体 産生 に も と ず くHFRSの 重症 化 の 可 能 性 を 示唆す るもの で， 抗血清 投与や ワクチ ン接種 によ る感染 あるい は発症 予防 を図る上の大きな障 害 と 考 え ら れ ，ADEの 発 現 機 序 と 中 和 抗 体 の 役 割 に っ い て 早 急 な 検 討 が 待 た れ て い た 。 本 論 文は2章 か ら 構成 さ れ， 第1章では マク ロファ ージ株 化細胞 を用い て， 抗体に よるハ ンタ ウ イ ル ス のADE発 現 の た め の 条 件 を 検 討 す る と と も にADEに 関 与 す る 抗 原 決定 基 の 同 定 を 行 っ た 。 第2章 で は 中 和単 ク 口ン抗 体とそ れか ら調整 されたFab断 片を用 い， マク口 ファー ジ株 化 細胞へ のハン タウ イルス の感染 と中和の機序を検討した。これらの成績は以下のごとくである。
1． 抗 体 に よ る ハン タ ウ イ ル スの 感 染 増 強 ： ハン タ ウ イ ル スを 抗 体 と 反 応さ せ て か ら マク ロ
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フ ァ ー ジ株 化 細 胞 に 接種 し ， 培 養4日 後 の 感 染 細胞 と 培 養 上 清の 感 染 価 をも とに ，ADE発現と 抗 体 濃 度と の 関 係 を 検討 し た 。 マ ク口 フ ァ ー ジ 細胞 には マウ ス由来 のJ 774.1とP388D1および ヒ ト 由 来 のU937を 使 用 し た 。 感 染 細 胞 と培 養 上 清 の 感染 価 の 測 定 は単 層Vero−E6細 胞で の infectious center assay (ICA)とperoxidase antiperoxidaseくPAP） 法 を 用 いて 行 っ た 。 中和 抗体価 は80％ フオー カス減 少法 により 測定し た。
ま ず ， マ ウ ス 由来 のJ 774.1細 胞に ´ 知0出mus型 のHantaan76ー118あ る い はRoと とus型 の SRー11株 をmultiplicityofinfection（m．o．i．） 約O．05で接 種し ，培養4日 目に感 染細胞 の 割 合 をICAとindirectimmunonuorescenceantibody（IFA） 法 で 測 定 し た 。 感 染 率 は Hantaan76―l18株で は0．08％ （80／10゜cells），SR―llではO．03％（28／lO゜cells）であった が ， 培 養上 清 の ウ イ ルス 感 染 価 は 両株 と も 検 出 限界 以下 （く20FFU／ 紺）で あった 。し かし，
免疫 血清を100倍 及至10，ooO倍に希 釈し てウイ ルスと 反応さ せてか ら細 胞に接 種したところ，感 染 細 胞 数と上 清の感 染価は いずれ の株 でも著 しく上 昇した （Hantaan76―118：318／10゜cens， 1780FFU／m己SR―11：660／l05cens，760FFU／ 紺 ） 。 こ の よ う な 免 疫 血 清 存 在 下 で の ADE現 象 は へ テ 口ウ イ ル ス の 場合 よ ル ホ モ ウ イル ス の方 がより 低い 血清濃 度域で 発現す るこ と が 観 察 さ れ た 。 ま た ，Hantaan76―l18株を 免 疫 血 清 と反 応 さ せ て か らP388Dl細 胞 とU937細 胞 に 接 種し た と こ ろ ，い ず れ の 細 胞で も 顕 著 なADEが認 められ た。 次に単 ク口一 ン性抗 体を 用 い て 検討 し た と こ ろ ，本 ウ イ ル ス のも つ2種 類 の膜 糖 タ ン パ クG1とG2に 対 す る 抗 体 はす べ て ADEを 示 し た が 核夕 ン パ ク に 対す る 抗 体 で は 全く 認 めら れなか った 。さら に膜糖 夕ンパ クに 対 す る 各 種単 ク ロ ー ン 性抗 体 の う ちADE能 を も っも の はす べて中 和活 性ある いは血 球凝集 抑制 活 性 （HAI） の い ずれ か を 保 有 した 。 し か し ，ADE能 を 持た な い 抗 体 はい ず れ の活性 をも示 さな か っ た 。すな わち， 膜糖タ ンパク の中 和ある いはHAIに関 与する 抗原 決定基 はマク 口ファ ー＿ ジ で のADEに も 関 与し て い る こ とが 明 ら か に な った 。 さら に中和 単ク 口一ン 性抗体 と中和 能の な いHAI単 ク 口 ― ン性 抗 体 を 比 較し た と こ ろ ， 前者 の 中和 活性は 高濃 度での み認め られた もの の 希 釈 と とも に 滅 弱 し ，逆 にADE作 用 が 発 現 し た。 こ れに 対して ，後 者では 高濃度 の抗体 でも 中 和 は 認 めら れ ず ，ADEの み 発 現し た 。 す な わ ち， マ ク口 ファ￣ ジに 対する ハンタ ウイル ス感 染 は 高 濃 度 の 中 和 抗 体 の 存 在 に よ っ て は じ め て 阻 止 さ れ る こ と が 判 明 し た 。 2．ADEと 中 和 の 機 序 の 検 討 ： マ ク 口 フ ァ ― ジ に お け る ハ ン タ ウイ ル ス のADEと 中 和 反 応 の機 序をさ らに 詳しく 検討す るため に，膜 糖夕 ンパク 上の中 和に関 与す る3種 類の抗原決定基（G 1b，G2a，G2c） に 対 す る 単 ク 口 ― ン 性 抗 体 お よ び そ れ ぞ れ の 抗 体 か ら 調 製 さ れ たFab 断 片 を 用 い てP388Dl細 胞 に 対 す るHantaan76−118株 の 感 染実 験 を 行 っ た。 使 用 さ れ た 中和
単 ク ロ ー ン 性 抗体 は す べて 高濃 度での みマク ロファ ージ の感染 を中和 した。 また，Glタン パク に 対 す る 抗 体 は，G2タ ンパ クに対 するも のより やや 強い中 和活性 を示す とと もに， より低 濃度 で もADE作 用 を 示 し た 。 し か し ， 中 和 単 ク ロ ー ン 性 抗 体 のFab断 片 で は 中 和 あ る い はADE の い ず れ も 認 めら れ な か っ た。 そ こ で 中 和抗 体 のFabと ウ イ ル ス との 複合 体に抗Fab抗 体を 反 応 さ せ た と こ ろ， 高 濃 度 のFab断 片 では 中 和 を 示 し たが ，Fab濃 度 の 滅少 ととも に感染 価が 上 昇 し て 最 高 値 に達 し た 後 次 第に 減 少 し た 。こ れ に対 して， 非中和 単クロ ン抗 体のFab断片 では 抗Fab抗 体を 加 え て も 中和 は 全 、 く 認め ら れ ずA‑DEのみ が発 現した 。この ように マクロ ファ ー ジ で の 中 和 は ウイ ル ス と 結 合し た2価 の 中和 抗 体 の 濃 度に 依 存 し て 発現 し，単 価のFabでは 全 く 認め られな かった 。
そこで 次にハ ンタウ イル スを中 和能を持たナょい抗体を介してマクロファ―ジに吸着させた後に 中 和 抗体を 作用さ せ， 吸着後 のウイ ルスに 対す る中和 抗体の 効果を 検討し た。 まず，Hantaan76
―118株 を非 中 和 単 ク ロー ン 性 抗 体 と反 応 さ せ て か ら4℃ でP 388Dl細 胞 に 接 種 し， 抗 体 のFc 部 分 とP388Dl細 胞 のFcレ セプ タ ー と 結 合さ せ る こ と によ っ て ， ウ イ ルス を 細 胞 に 吸着 さ せ た 。 続いて これに 中和 単クロ ーン性 抗体を 加え て4℃ で反 応させ てから 良く洗 浄し，37℃で16− 18時間培 養した 後，感 染細 胞数を 測定し て，細 胞吸 着ウイ ルスに 対する 中和抗体の効果を検討し た 。す なわち ，マク 口ファ ージ に直接 ウイル スを接 種した 場合 ，ウイ ルスの吸着効率は著しく低 く ， 細胞感 染率はO． 08％(8／l04cells)で あった 。一方 ，ウ イルス に非中 和抗体 を添 加して か ら 細 胞 に 接 種 する と 細 胞 感 染率 は0．8％(80/104cells)に増 加した 。しか し，こ れら の細胞 吸 着 ウイ ルスに 中和単 クロー ン性 抗体を 反応さ せると ，感染 細胞 の割合 は再び滅少した。また，こ こ で もGlタ ン パ ク に 対 す る 中 和 抗 体の 中 和 活 性 はG2タ ン パ クに 対 す る も の より 明 ら か に 高 か った 。
以 上 の ごと く ， マ ク 口フ ァ ー ジ に お ける ハ ン タウイ ルスのADE現 象は ウイル スと結 合した 抗 体 のFc部 分と マ ク ロ フ ァー ジ のFcレセ プ 夕 一 と の結 合 に よ っ て 細胞 へ のウイ ルス吸 着が容 易 に な っ た 結 果 と判 断 さ れ た 。し か も そ のADEに 関与 する抗 体はハ ンタウ イル スの膜 糖夕ン パク に 対 す る 抗 体 のう ち 中 和 活 性あ る い はHAI活 性 を有 するも のに限 られ， 抗核 タンパ ク抗体 では 全 く認 められ なかっ た。ま た， 中和抗 体はマ クロフ ァージ にお けるハ ンタウイルスの感染に対し て 高 濃 度 で は 中和 を ， 低濃 度で は感染 増強を 示し，1種 類の抗 体が 濃度に 依存し た2っの相 反す る 作用 を有す ること が証明 され た。こ れらの 知見は ハンタ ウイ ルスの 免疫，持続感染や発病機序 な ど を 検 討 す る上 の 基 礎 資 料と な る ば か りで な く ，HFRSワ ク チ ンを 開 発する 上にも 極めて 重 要 な意 義を持 っと思 われる 。
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学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
橋本 板倉 小沼 高島
信 夫 智 敏 操 郁 夫
腎 症 候 性 出 血 熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome： HFRS)は 主 に げ つ 歯 類 か ら人が 罹患 し，高 熱，出 血傾向 及び 腎臓障 害を起 こす極 めて重 篤な ウイル ス性人獣共通伝染病で ある。 本病 の病原 ウイル スはブ ニヤ ウイル ス科の ハンタ ウイル ス属 に属し ，由来動物種に対応し た4種 類 の血清 型があ る。こ れま で，ド ブネズ ミにお ける 本ウイ ルスの 感染調 査では 中和 抗体価 の高い 成熟 個体か らのウ イルス 分離 率が高 く，抗 体存在 下での 持続 感染の 機序を巡って大きな関 心が寄 せら れてい た。そ こで著 者は 培養マ クロフ ァージ を用い ，抗 体存在 下でのハンタウイルス の感染 と中 和の機 序にっ いて検 討を 行った 。本論 文はこ れらの 成績 をまと めたもので英文62頁か らなり ，参 考論文4編 を付し ている 。 ，
1．抗 体 に よ る ハン タ ウ イ ル スの 感 染 増 強 ： 供試 ハ ン タ ウ イル ス と し て ´ゆ0出mMs型Hantaan 76―118株とRaと とUs型SR−ll株 を使用 した。 マク 口ファ ージ細 胞には マウ ス由来 のJ774．1と P388Dlおよ び ヒ ト 由 来のU937を 使 用 し た 。 また ， 感 染 細 胞と 培 養 上 清 の感 染価の 測定は 単層 VerO−E6細 胞 で のinfeCtiouSCenteraSSay（ICA） とperoxidaSeantiperOXidaSeくPAP冫 法 を 用 い て 行 っ た 。 中 和 抗 体 価 は80％ フ オ ― カ ス 減 少 法 に よ り 測 定 し た 。 マ ウ ス由 来のJ774．1細 胞にウ イル スを感 染の多 重度約O．05で接 種し， 培養4日目 に感染 紐胞 数 をICAとindirectimmunofluorescenceantibody（IFA） 法 で ， ま た 培 養 上 清 の 感 染価 を PAP法 で 測定 し た 。 細 胞の 感 染 率 はHantaan76−l18株 で はO．08％ ，SR―ll株で はO．03％ で あ った が， 培養上 清の ウイル ス感染 価は両 株と も検出 限界以 下．（ く20FFU／甜 ）であ った。 し かし， 免疫 血清をlO，ooo倍希 釈して ウイル スと反 応させ てから細胞に接種したところ，感染細胞 数 と上 清 の 感 染 価は い ず れ の株 でも10ー100倍 上昇 し，抗 体依存 性感染 増強（antibodydepen― dentenhancement：ADE） 現 象 の 発 現 が観 察 さ れ た 。ま た ， 抗 血 清を 添 加 し て 感 染価 を 測 定 した場 合， 抗血清 とホモ ウイル スの 組合せ ではへ テロウ イルス に比 べて， より高希釈域で感染増 強 を示 し ，ADE現 象 に も 特 異性 と 交 差 反 応性 の あ る こ とが 判 明 し た 。 そこ で本ウ イル スの2種 類 の 膜 糖 夕 ン パ ク ，GlとG2に 対 す る 単 ク ロ ー ン 性 抗 体 を 用 い た と こ ろ ，ADE能 を も つ
ものはすべて血球凝集 抑制活性(HAI)を示したが，中和活性はそれらの一部でしか認められ なかった。しかし，ADE能のない抗体はHAIと中和 のいずれの活性も示さなかった。また，
中和単クローン性抗体の中和活性は高濃度でのみ認められ。低濃度では逆にADE作用が発現し た。これに対して，HAI活性のみをもつ抗体では高 濃度でも中和が認められず，ADEのみが 発現した。さらに核夕 ンパクに対する単ク口ーン性抗体ではADEは全く認められなかった。
2． ADEと中和の機 序の検討：マク口ファージに おけるハンタウイルスのADEと中和反応 の機序をさらに詳しく検討するために，膜糖夕ンパクに対する単ク口ーン性抗体ならびにそれら の抗体から調製 されたFab断片を用いて，P388Dl細胞に対するHantaan76−118株の感染実 験を行った。使用された中和単ク口ーン性抗体はすべて高濃度でのみマクロファ―ジの感染を中 和した。しかし，Fab断片のみでは中和あるいはADEのいずれの活性も認められなかった。
そこで中和抗体のFabとウイルスとの結合物に抗Fab抗体を反応させたところ，高濃度のFab 断片ではウイルスの中和が認められたが，Fab濃度の減少とともに感染価が次第に上昇し，顕 著なADEが発現した。 これに対して，非中和単クローン性抗体のFab断片では抗Fab抗体を加 えても中和は全く認められずADEのみが発現した。このようにマク口ファ―ジでの中和はウイル スと結合した2価の中和抗体の濃度に依存して発現し，単価のFabでは全く認められなかった。
次にハンタウイルスを非中和抗体を介して低温でマクロファージに吸着させてから中和抗体を 作用させ，吸着後のウイルスに対する中和抗体の効果を検討した。すなわち，マク口ファージに ウイルスを直接接種した場合，ウイルスの吸着効率は著しく低いが，ウイルスに非中和抗体に結 合させてから細胞に接種すると感染率は約10倍上昇した。しかし，これらの細胞吸着ウイルスに 中和単クローン性抗体を反応させると，感染細胞の割合は再び減少し，細胞内でのウイルス感染 過程の阻害が確認された。
以上のごとく，本研究によって，マク口ファ―ジにおけるハンタウイルスのADE現象はウイ ルスと、結合した抗体のFc部分とマク口ファージのFcレセプターとの結合によって細胞へのウ イルス吸着が容易になった結果と判断された。しかもそのADEに関与する抗体はハンタウイル スの膜糖タンパクに対する抗体のうち中和活性あるいはHAI活性を有するものに限られ，抗核 タンパク抗体では全く認められなかった。また，中和抗体はマク口ファージにおけるハンタウイ ルスの感染に対して高濃度では中和を，低濃度では感染増強を示し，1種類の抗体が濃度に依存 した2っの相反する作用を現わすことが証明された。これらの知見はハンタウイルスの持続感染 と中和反応の機序を解明する上で貢献するところが大きい。よって審査員一同は姚建勝氏が博士
（獣医学）の学位を受ける資格を有するものと認める。
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