博士（医学）高須 毅・
学位論文題名
Detection of Latent Herpes Simplex Virus DNA and RNA in Human ;eniculate Ganglia by the Polymerase Chain Reaction
（ ヒ卜膝神経 節における 潜伏単純ヘ ルペスウイ ルスDNAお よび RNAのPCR法 に よる 検 出）
学位論文内容の要旨
緒 言
特発性末梢性顔面神経麻痺（ベル麻痺）の病因のーっとして、ウイルス感染が 挙げられており、なかでも単純ヘルベスウイルス(Herpes simplex virus; HSV）は 神経親和性があり、また知覚神経節に潜伏感染後に再活性化することより、原因 ウイルスのーっとみなされている。しかし従来の手技を用いての、ヒト剖検症例 や顔 面神経減荷手術症例から得られた膝神経節を材料とした検討では、HSVは 証明されえなかった。他方、これまでの患者血清抗体価の測定や動物感染モデル での解析のみでは、ヒトにおける潜伏ウイルスと疾患とを結び付けるのに必要十 分と は言えない。そこで本研究では、ヒト剖検症例の膝神経節におけるHSV潜 伏感 染を直接証明する手段としてPolymerase Chain Reaction (PCR)法および Reverse Transcription‑PCR (RT‑PCR)法 を 用 い 検 討 を 行 っ た 。
材 料と方法
（1）材料
顔面神経麻痺の既往あるいは剖検時にHSV感染症の現病歴のない成人剖検症例 11例より両側側頭骨を摘出後、直ちに電気ドリルにて内耳道より顔面神経水平部 まで削開し、膝神経節部に到達した。摘出された同部はー70℃で保存の後、DNA ある いは全RNAを抽出した。また、三叉神経節を同時に摘出し、同様に核酸抽 出を行った。さらにコントロールとして、HSV急性および潜伏感染マウス大脳、
新生児剖検症例より摘出された神経節、成人剖検症例の脾臓、Hirt法により抽 出し たHSV‑1，2型、水 痘・帯状疱 疹ウイルス(VZV）、ヒトサイトメガロウイ ルス(HCMV）の各ウイ少スDNAを用いた。
（2）DNA PCR
HS V‑lのthymidine kinase (TK)遺伝 子部分に相当するprimer対を作成し、抽出 したDNA亅 ．Vg，あ．．る・いはウイルスDNAlngを用いて30サイクルの増幅を行い、
反応量 の1/4をアガ ロースゲ ルにて電 気泳動後、ナイロンフイルターに転写した。
そ の 後 、 当 該primer対 領 域 を 含 むHSV‑1 DNA BamHIQ断 片 を 鋳 型 と し てPCR に よ り 増 幅 し た110塩 基 対 のDNAを 、 さ ら にPCRに よ り32P̲dCTPで 標 識 し た DNAプ ロ ー ブ を 用 い て 、 Southem blot hybridizationを 行 っ た 。 （3）RT‑PCR
増幅領 域としてHSV‑1のTK部分およびlatency‑associated transcript (LAT)部分 を 選 定 し 、primer対 を 作 成 し た 。 抽 出 し たRNA5Vgに つ い て 、 各primer対 の い ず れ か1方向 のprimerの 存 在下 で 逆転 写 酵 素反 応 を行 い 、cDNAに変 換 した 。 そ の 後 、 こ のcDNA合 成 反 応 液 に 対 し 、cDNA合 成 時 に 加 え たprimerと 対 応 す る 逆 方 向のprimerを さ ら に加 え 、30サ イク ル のPCR反 応 を行 い 、 アガ ロ ース ゲ ルにて電気泳動を行った。
結 果
（1）DNA PCRの感度と 特異性
段 階 希釈 し たHSV−1DNAを 用い た 検討 で は 、一 連 の 反応 ・ 検出 法 に よりHSV‑
1 DNA 0.001 pg（お お よそ7コ ピ ー のHSV‑1相当 ） まで 検出 可能であ り、110 bp の 増 幅 産 物 が 確 認 さ れ た 。 ま た 、HSV−2DNAに 対 す る 反 応 で は 、 約300 bpと 110 bpの2本 の バ ン ド が 認 め ら れ 、HSV−1DNAと の 判 別 が 可 能 で あ っ た 。 他 方 、VZV DNAお よ びHCMV DNAで は 、 い ず れ の 特 異 的 増 幅 も 見 ら れ な か った 。 コ ン トロ ー ル組 織 を 用い た 検 討で は 、HSV潜 伏 感染 マ ウス 大 脳 よりHSV−1が 証明 された一 方、新生 児剖検症 例より摘 出された 各神経節あ るいは成 人剖検症例 の脾 臓からのDNAでは目的 の増幅は 得られな かった。
（ 2） 成 人 剖 検 症 例 か ら の 三 叉 お よ び 膝 神 経 節 に 対 す るDNA PCR
，三 叉神経節 では17側中16側(94u/o）に、 また膝神経節では17側中15側（88 u/o) に、110 bpの増幅産 物が検出 された。 他方、300 bpの バンドは 認められず 、これ らの 増幅はHSV‑1由 来である と考えら れた。
（3）RT‑PCR
HSV急 性 感 染 マ ウ ス 大 脳RNAを 用 い た 場 合 に は 、cDNA合 成 時 にTK mRNA に 相 補的 な 方 向のprime「 を加え た場合に のみ当該 産物の増 幅を認め、TKの逆方 向 のprimerある い はLATの 各primerを 加え た 際 には 増 幅 は確 認 でき な か った 。 一 方 、 ヒ ト 三 叉 神 経 節 お よ び 膝 神 経 節 よ り 抽 出 し たRNAで は 、TK mRNAは 認め られず、LATの転写の みが確認 された。
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考 察
ヒト 三 叉 神経 節 に潜 伏 し たHSVー1の 再活 性 化 が□ 唇 ヘル ベ スを 引き起こ すと いうことがほぼ確立した概念である一方、特発性末f肖性顔面神経麻痺（ベル麻痺）
の 原 因 の ー っ と し てHSVが 考 え られ な が ら、 顔 面神 経 知 覚枝 の 神経 節 で ある 膝 神 経 節に お けるHSV潜 伏感 染 の 探索 は従来不 成功に終 わってき た。しか し我々は in situ hybridization (ISH)法を剖検症例に適用することによって、ヒト三叉神経節 (81％） とほぼ同 頻度(71％） でヒト膝 神経節にお けるHSV‑1の潜伏を確認した。
さ ら に本 研 究に お い て、 同 じ くヒ ト剖検 症例より 摘出した 両神経節 に対してPCR 法 を 適用しHSVの 検索を行 った結果、 それぞれ94u/o、880/0の頻度 でHSV‑1が検出 さ れ た 。ISH法 と 比 較 しPCR法 で は 、 組 織 全 体 を 検 討対 象 と でき 、 また 感 度 も 優れているため、高頻度に検出可能であったと考えられる。
HSVの 潜 伏 感 染 期 に は そ の 増 殖 型 感 染 期 と 異 なり 、 、p、ア 遺 伝子 か ら の カ ス ケ ー ド 的 発 現 は 起き て い ない ふ し かしLATと呼 ば れ る転 写 産物 の み が潜 伏 感 染 時に比較 的特異的 に読まれて おり、 遺伝子群 のーつで あるinfected−cell protein number zero (ICPO)のmRNAと は 逆向 き に転 写 さ れて いる 。従って この LATもHSV潜 伏 感 染 検 出 の タ ー ゲ ッ ト と な る 。 本 実 験に お い てそ の 目的 の た め RT‐PCR法 を 一 部 の 症 例に 適 用し た 結 果、 三 叉神 経 節 、膝 神 経節 の い ずれ に も HSV゛1LATの 発 現 が 証 明 さ れ 、 他 方 、1K遺 伝 子 の 発 現 は 確 認 さ れ な か っ た 。 一 方 、HSV急 性 感 染 マ ウ ス 大 脳 よ り 抽 出 し たRNAを 用 い た 場 合 の 結 果 は そ の 逆 で あっ た 。膝 神 経 節に お け る潜 伏HSV−1の 証 明 が直 ち にそ の 再活性化 とべル 麻 痺 との因果 関係には 結ぴ付かな いが、今 後の研究 において 本法が再 活性化の 証 明に有用であると考えられた。
結 語
PCR法 お よ びRT‑PCR法 を 、 ヒ ト 剖 検 症 例 よ り 摘 出 さ れた 膝 神経 節 に おけ る 潜 伏HSV‑1の検 出 に適 用 し 、以 下 の 結果 を 得た 。
（1）PCR法 に より 膝 神 経節17側中15側(88u/0） にHSV‑1DNAが検出 された。
（2）RT→PCR法 に よ り 膝 神 経 節 でH：sV‐1LATの 発 現 が 検 出 で き た 。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Detection of Latent Herpes Simplex Virus DNA and RNA in Human Geniculate Ganglia by the Polymerase Chain Rea,ction
（ヒト膝神経節における潜伏単純ヘルペスウイルスDNA および RNA の PCR 法による検出）
目 的 ： 特 発 性 末 梢 性 顔 面 神 経 麻 痺 （ ベ ル 麻 痺 ） の 病 因 の ー っ と し て 、 ウ イ ル ス 感 染 が 挙 げ ら れ て お り 、 な か で も 単 純 ヘ ル ベ ス ウ イ ル ス(Herpes simplex virus;
HSV)は 原 因 ウ イ ル ス の ‐ う と み な さ れ て い る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 ヒ ト 剖 検 症 例 の 膝 神 経 節 に お け るHSV潜 伏 感 染 を 直 接 証 明 す る 手 段 と し てPolymerase chain reaction (PCR)法お よぴReverse transcription―PCR(RT―PCR)法を用 い検討 を行った 。 材 料 ： 顔 面 神 経 麻 痺 の 既 往 あ る い は 剖 検 時 にHSV感 染 症 の 現 病 歴 の な い 成 人 剖 検 症 例11例 よ り 両 側 顔 面 神 経 膝 神 経 節 お よ ぴ 三 叉 神 経 節 を 摘 出 し 、 −7(PCで 保 存 の 後、DNAある い は 全RNAを抽 出 し た。
方法 ：HSV−1のthymidine kinase (TK)部分 お よ ぴlatency−associated transcript (LAT)部 分 を PCRの 増 幅 領 域 と し て 選 定 し た 。 DNA PCRで は 、 抽 出 し たDNA1 vg あ る い は ウ イ ル スDNAlngを 用 い て 30サ イ ク ル の 増 幅 を 行 い 、 反 応 量 の1/4 を ア ガ ロ ー ス ゲ ル に て 電 気 泳 動 後 、 ナ イ ロ ン フ イ ル タ ー に 転 写 し 、32P−dCTPで 標 識 し たDNAプ 口 ー ブ を 用 い て 、Southern blot hybridizationを 行 った 。 ま たRT− PCRで は 、 抽 出 し た RNA5嵋 に つ い て 、 各 primer対 の い ず れ か 1方 向 のprimer の 存 在 下 で 逆 転 写 酵 素 反 応 を 行 い 、cDNAに 変 換 後 、 こ の cDNA合 成 反 応 液 に 対 し 、 逆 転 写 酵 素 反 応 時 に 加 え たprimerと 対 応 す る 逆 方 向 のprimerを さ ら に 加 え 、 30サ イ ク ル のPCR反 応 を 行 い 、 DNA PCRの 場 合 と ほ ぼ 同 様 に 検 出 を 行 っ た 。
結 果 ： （1） コ ン ト 口 ー ル 組 織 お よ ぴ ウ イ ル スDNAを 用 い た 検 討 で は 、 一 連 の DNA PCRお よ び そ の 検 出 法 に よ り 、 HSVー lDNAを 特 異 的 に 判 別 で き た 。 ま た 、 段 階 希 釈 し た HSV‑1 DNAを 用 い た 検 討 で は 、HSV― 1DNA 0.001 pg（ お お
