博 士 （ 薬 学 ） 野 村 学 位 論 文 題 名
浮
免疫系 遺伝子の 転写調節 因子とし てのMSSP の解析
― Fas 誘導アポトーシス系における MSSP の機能を中´心として一
学位論文内容の要旨
MSSP (c‐myc gene single strand binding 2roteins)は，ヒトc‑myc遺伝子第1エキソンの 約2 kb上 流に 存 在 す るDNA複 製開始 部位／ 転写エン ハンサ ー(myc(H‑P)21配列）に 直接結 合す る転写 因子とし て本研 究室で 単離・ 同定された．またc‑Mycと複合体を形成することか ら ，MSSPはc‑Mycと 協調 的 な機 能がこ れまで 多く報 告され ている，MSSPは現 在5つの スプ ラ イ シ ン グ バ リ ア ント が 報 告 され て お り ，そ の す べ てに お い てRNA結合 モ チ ー フ(RNA binding motif)を2ケ 所 有し ，RNA結合 モチー フがDNAと の結合 ，転写 ，DNA複製 ，アポ 卜 ー シスに 必須で あるこ とが明 らかと なってい る．ま たMSSPはc‑mycの転写 エンハ ンサー に 結合し，転写制御を行うほか，甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)，a‑smooth muscle actin， MHC classI，MHC class IIな ど の 遺 伝 子 も 転 写 制 御 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ． さら なるMSSPの 機能や 個体レ ベルで の表現型を解析するため，本研究室でMSSP(‑/‑)マウ スを 作製し た．その 結果，MSSP(‑/‑)マウ ス新生児には一部胎生致死傾向が見られるほか，
プロ ゲステ ロン量低 下など のホル モン異 常，E2.5・8細胞期における初期発生段階での細胞 死が 認めら れた．MSSPがアポ トーシ スを誘 導するこ とは既 に細胞 レベルで明らかとなって おり ，MSSP(‑/‑)マ ウスの 表現型か らもMSSPが生死を司る分子であることが明らかとたって いる ．この ことから 本研究 では，MSSPによ るアポト ーシス 誘導機 構を個体レベルおよび分 子レベルで解析した．
は じめにc‑Mycが制 御する 遺伝子 の発現がMSSP(+/+)マウ スとMSSP(‑/‑)マウス 組織で 変 化 するか 解析を 行った ．この 結果， デスレセ プター であるFas (CD95)はMSSP(‑/‑)マウス のほ ばすべ ての組織 で減少 が認め られた ，一方，c‑Mycが直接転写制御するFas Ligandでは 変化 が認め られなか った． さらに 生後1日 以内のマウスより調製した初代培養線維芽細胞で のFasの 発現もMSSP欠損細 胞では 減少し ていた ，MSSP欠損 によりFasの遺伝子発現が低下す るた め，MSSP(‑/‑)マウス はアポト ーシス 不全であり，自己免疫疾患様の病態にあると考え られ た．そ こではじ めに初 代培養 胸腺細 胞をMSSP(+/+)マウス とMSSP(‑/‑)マウスから調製 し ，抗Fas抗 体処置 によル アポト ーシス 誘導を 行った ．この 結果，MSSP欠損の 胸腺細 胞で は細 胞死が 減少し， 細胞レ ベルで のアポ トーシ ス抵抗 性が明 らかとなった．一方，個体レ ベル での致 死性，ア ポトー シズ， 組織の 損傷を解析するため，抗Fas抗体を尾静脈より投与 し ，肝臓 組織標 本を用 いたTUNEL assayを行っ た，こ の結果 ，MSSP(+/+)マ ウスで は抗Fas
一 825ー
抗 体 投 与 で 死 亡 例 が1例 出 た ほ か ， ほ ば す べ て の マ ウ ス で 肝 臓 組 織 に お け る 出 血 が 確 認 さ れ f ．
た ． ま た ，TUNEL assayの 結 果 ，MSSP(‑/‑)マ ウ ス はMSSP(+/+)マ ウ ス に 比 ベ ア ポ ト ー シ ス 陽 性 細 胞 が ほ ば 半 減 し た こ と か ら ，MSSP欠 損 に よ り 個 体 レ ベ ル で も ア ポ ト ー シ ス 抵 抗 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た ，
MSSPが 転 写 因 子 で あ る こ と か ら ， 直 接Fasの 遺 伝 子 発 現 を 転 写 レ ベ ル で 制 御 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ． そ こ でFas遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 を ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 に 連 結 し た べ ク タ ー と と も にMSSP発 現 ベ ク タ ー をMSSP(‑/‑)線 維 芽 細 胞 に 共 導 入 し ル シ フ ェ ラ ー ゼ ァ ッ セ イ を 行 っ た 結 果 ，MSSP依 存 的 な プ ロ モ ー タ ー 活 性 の 上 昇 が 認 め ら れ た ， そ こ で さ ら に MSSP依 存 的 に Fas遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 活 性 を 上 昇 さ せ る 領 域 を ル シ フ ェ ラ ー ゼ ァ ッ セ イ お よ びChIP assayを 行 い 解 析 し た 結 果 ，‑1035か ら‑635の 領 域 が 得 ら れ た ． こ の 領 域 を 検 索 し た 結 果 ，MSSPコ ン セ ン サ ス 配 列(AIT CT A/T」 ｀ 汀T） で あ る TClAAT の 存 在 を 確 認 し た ， そ こ で TC1、AAT を 含 むFas遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 を プ ロ ー ブ と し た ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ を 行 っ た 結 果 ， コ ン セ ン サ ス 配 列 特 異 的 な シ フ ト バ ン ド が 検 出 さ れ た ． さ ら に 抗MSSP抗 体 を 用 い た ス ー パ ー シ フ ト ア ッ セ イ を 行 っ た と こ ろ 抗MSSP抗 体 特 異 的 な シ フ ト バ ン ド が 検 出 さ れ た こ と か ら ， ．MSSPは Fas遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 の ‐l035か ら ．635の 領 域 に 存 在 す る TC1、AA丁 配 列 に 結 合 す る こ と が 明 ら か と な っ た ．
ま たMSSPの ス プ ラ イ シ ン グ バ リ ア ン ト で あ る こ と が 既 に 明 ら か と な っ て い るYClはIL，2 受 容 体q鎖 （CD25） のr叩ressorタ ン パ ク 質 と し てGenBankに 登 録 さ れ て い る ．MSSP（ ‐ ′ う マ ウ ス で はMSSP欠 損 に よ りIL‐2受 容 体a鎖 の 発 現 抑 制 が 解 除 さ れ る こ と で 発 現 が 増 加 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た． そ こ でMSSP（ 十/十 ） マ ウ ス とMSSP（ ． ／ ‐） マ ウ ス か らIL‐2受容 体 の 発 現 が 高 い り ン パ 系 組 織 で あ る 脾 臓 を 用 いRr‐PCRを 行 っ た 結 果 ，MSSP（ ‐ ／ ‐ ） マ ウ ス でIL−2受 容 体a鎖 の 発 現 の 増 加 が 認 め ら れ た ． マ ウ スIL‐2受 容 体a鎖 プ ロ モ ー タ ー 領 域 を ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 に 連 結 し た べ ク タ ー とMSSP発 現 ベ ク タ ー をMSSP（I/‐ ） 線 維 芽 細 胞 に 共 導 入 し ル シ フ ェ ラ ー ゼ ァ ッ セ イ を 行 っ た 結 果 ，MSSP依 存 的 な プ ロ モ ー タ ー 活 性 の 減 少 が 確 認 さ れ た ， マ ウ ス lL‐2受 容 体a鎖 プ ロ モ ー タ ー 領 域 にMSSPコ ン セ ン サ ス 配 列 が 存 在 す る か 検 索 を 行 っ た と こ ろ ，7ケ 所 存 在 す る こ と を 確 認 し た ，MSSPは こ の コ ン セ ン サ ス 配 列 に 結 合 しIL．2受 容 体a鎖 の 発 現 を 制 御 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る ．
IL‐2受 容 体a鎖 は マ ウ ス に お い て は 機 能 的IL＿2受 容 体 形 成 に 必 須 で あ り，MSSP（‐ ′ ‐ ） マ ウ ス で はIL−2シ グ ナ ル 伝 達 過 剰 に よ り 生 体 に 異 常 が 生 じ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る ． 一 方 ，IL‐2 受 容 体a鎖 は 自 己 反 応 性T細 胞 の 抑 制 を 行 う 「 制 御 性T細 胞 」 の マ ー カ ー （CD4℃D25十 ） と し て 報 告 さ れ て い る ． こ の こ と か らMSSP（ 一/I） マ ウ ス はFasの 減 少 に よ ル ア ポ ト ー シ ス 不 全 と な り 自 己 免 疫 疾 患 様 の 病 態 に あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た が ， 制 御 性T細 胞 の 増 加 に よ り 自 己 免 疫 疾 患 様 の 病 態 は 抑 制 さ れ て い る 可 能 性 も 示 唆 さ れ る ． 以 上 よ りMSSPは 広 く 免 疫 系 分 子 の 発 現 制 御 を 行 い ， ま た 免 疫 寛 容 ， 免 疫 バ ラ ン ス に 関 与 す る 分 子 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．
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学位論文審査の要旨 主査 教授 有賀寛芳 副査 ゛教授 横沢英良 副査 助教授 松本健一 副査 助教授 川原裕之
学 位 論 文 題 名
免疫系遺伝子の転写調節因子としてのIVISSP の解析
一Fas 誘導アポトーシス系におけるMSSP の機能を中心として―
本 研 究 室 に お い て ヒ トc‑myc遺 伝 子 の 第1エ キ ソ ン の 約2kb上 流 にDNA複 製 開始 ／ 転 写 エ冫 ン サ ー領 域(myc(H，P)21） が存在 すること を明ら かにし た．こ の配列 特異的 に結合 するタ ンパク 群と してMSSP(c‑myc single strand binding 2roteins)が同 定され た．MSSPの機能解明のため，本 究室でMssp欠損（．／．）マウスを作製した．今回Mssp(‑/‑)マウスの主要な組織においてアポトーシ に 関 与す るDeath Receptor，Fas(CD95)の 発 現レベ ルが顕 著に低 下して いること を明ら かにし た 細 胞 及び 個 体 レ ベル で も ア ポト ー シ ス 刺激 に 対 し ，Mssp(‑/‑)の 感 受性 は 低 下 して い た ． さら MSSPが 転 写 レ ベ ル でFas遺 伝 子 発 現 の 調 節 を 行 っ て い る こ と を 明 ら か に し た ． 同 様 にMSSP IL‑2受 容 体a鎖(CD25)の 遺 伝 子 発現 も 調 節 した こ と か ら， 広 く 免 疫系 遺 伝 子 の調 節 因 子 とし で MSSPの可能性が示唆された，
！：Mssp(‑/‑空丕廷壷V歪FascCD95)c登葱ヒ釜坐
Mssp(‑/‑)マ ウス，野 生型マ ウスの主要組織におけるFas夕ンバク質量を比較しところ、
Mssp(‑/‑)マウスの組織において顕著なFas夕ンパク質の低下を確認した．さらにMssp(‑/‑)マウ ス組織で見られるFas遺伝子発現の低下は細胞レベルでも同様であり，MSSP(‑/‑)線維芽細胞で Fas遺伝子発現が低下していた．
2：拭Fas ffi体によるアポトーシス感受性O変
5｜7週齢の雄性マウス（野生型マウス，Mssp（‐／・）マウス）に抗Fas抗体O．5mひ（g静脈内投与TUN assayを行った．Mssp（‐／‐）マウスでは野生型マウスのアポトーシス陽性細胞数に比べほぽ半減し おり ，個体 レベル でもア ポトー シス感 受性が低 下して いるこ とが明 らかと なった ，同様 にMssp（1 初代培養胸腺細胞にFas依存アポトーシスが誘導は半減していた。
≧ ： 転 塁国 王 堕墨塁￡ のFas遺伝王登 現へQ関与 ―827 ‑
MSSP発 現 ベ ク タ ー とFas遺伝 子上 流を ル シフ ェラ ーゼ に連 結 した べク ター をMssp(‑/‑)線 維萄 胞 に 共 導 入 し ル シ フ ェ ラー ゼア ッ セイ を行 った ． この 結果 ，MSSP用 量 依存 的な 活性 が現 れ た事 り ，MSSPが 転 写 因 子 と し てFasの 遺 伝 子 発 現 を 制 御 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 4． MSSPに よ るF埜 遺 伝 王Q転 塁 麺 範 趣 壇Q固 定
MSSP導 入 に よ ル プ ロ モ ー タ ー 活 性 が 変 化 す る領 域を 決定 す るた め，Fas遺伝 子上 流と そ の欠 変 異 体 を ル シ フ ェ ラ ー ゼ遺 伝子 ベ クタ ーに 連結 さ せ，HeLa細胞 に導 入 しル シフ ェラ ーゼ ア ッセ を 行 っ た と こ ろ ，‑1035か ら‑635間 の 領 域 に お い てMSSP導 入に よる プ ロモ ー夕 一活 性の 変 化が 認 さ れ た ． さ ら にMSSPのFas遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 へ の 結 合 を 抗MSSP抗 体 を 用 い た ク 口 チ ン 免 疫 沈 降 法 で 確 認 を 行 っ た ．
こ の 結 果 ，MSSPがFas遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 上 の‑1035か ら‑635問 の 領 域 に 結 合 しFas遺 伝 子 転 写 活 性 化 を 行 う こ と が 明 ら か と な っ た ． さ ら に こ の 領 域 にMSSPの コ ン セ ン サ ス 配 (A/TCTA/TA/TT)が 存 在 す る か 否 か の 検 討 を 行 っ た と こ ろ ，TCTAAT配 列 の 存 在 を 確 認 し た ，
5． MSSPによ るFas遺 伝 王謹 怨倒 御
MSSPがFasプ ロ モ ー タ ー 領 域 に 存 在 す る コ ン セ ン サ ス 配 列 特 異 的 に結 合 し，Fas遺伝 子発 現 御 に 関 与 す る かMSSPコ ン セ ン サ ス 配 列 を 含 むFasプ ロ モ ー タ ー 領 域 を プ ロ ー ブ に し た ゲ ル シ ト ア ッ セ イ ， さ ら に 抗MSSP抗 体 を 用 い た ス ー パ ー シ フ ト ア ッ セ イ ， そ し てMSSPコ ン セ ン サ 配 列 を 除 い たFas遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 領域 を ルシ フェ ラー ゼに 連 結し たべ ク夕 ￣ を用 いた ル フ ェ ラ ー ゼ ア ッ セ イ に よ り 検 討 し た ．Fas遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 に 存 在 す るTCTAATを 含 む 列 にMSSPが 結 合 す る こ と が ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ 及 び 抗MSSP抗 体 を 用 い た ス ー バ ー シ フ ト ア セ イ に よ り 明 ら か と な っ た ． さ ら にMSSP結 合 配 列 と 考 え ら れ るTCTAMを 除 い た ベ ク タ ー を いた ．ル シフ ェラーゼアッ セイでは，プロモーター活性 が減少した．この結果，MSSPはFas promoi 領 域 に 存 在 す る コ ン セ ン サ ス 配 列 に 結 合 しFas遺伝 子発 現を 制御 す るこ とが 明ら か とな った ．
壘：Mssp(‑/‑)ヱ空丞腫 魅睦壷けるIL‑2量室笠oclS9t(CD2s)Q登現
本 研 究 室 で ク ロ ー ニ ン グ し たMSSPと 他 グ ル ー プ よ ル ク ロ ー ニ ン グ さ れ た ヒ トYCl(GenBd L11289） は ス プ ラ イシ ング の違 いに よ り生 ずる こと が 明ら かと なっ てい る ．ヒ トYClはIL‐2受 体（x鎖のrepressor夕 ンバク質として登録されている．Mssp（‐／うマウス，野生型マウスの脾臓を用 てlmPCR法を行ったとこ ろ，Mssp（‐ルマウス脾臓 で凡．2受容体（x鎖が増加し ていた．IL．2Recep a鎖 は，p鎖 そし て償 と結 合しIL2高親 和性レセ プターを形成することから，MSSP（・ノうマウス脾 ではIL．2シ グナ ルの 異 常が 予想 され る ．ま た凡 ．2受容 体伐 鎖が 自 己反 応性T細 胞の 抑制に関与 る と い う 「 制 御 性T細 胞 」 の 特 異 的 マ ー カ ー と し て も 報 告 さ れ て お り ，MSSPは 自 己 の 免 疫 バ ンスにも関与する可能 性も示唆された，
こ の よ う に ， 野 村 淳 は 精 力 的 にMSSPの 機 能 解 析 を 行 な い ， 多 く の 成 果 を あ げ た ． こ れ ら の 業 績 は 野 村 淳 に 博 士 （ 薬 学 ） の 学 位 授 与 に 十 分 値 し ， 推 薦 す る も の で あ る ．
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