博士（薬学）岩野俊介 学位論文題名
多環芳香族炭化水素が誘発する アテローム性動脈硬化の発症機構
学位論文内容の要旨
3‑Methylcholanthrene (MC)やbenzo[a]pyrene (B[a]P)などに代表される多環芳香族炭化 水 素(PAH)類 は タ バコ 煙 ， 自動 車 の排気 ガスおよ び食品の 焼焦げに 多く含まれ ，生体内 に取り 込まれる とアテロー ム性動脈 硬化，胎児奇形および発がんなどの重篤な毒性を誘発 す るこ と が知 ら れ てい る ．一 般 にPAH類によっ て誘発さ れる毒性 はりガンド 依存性の 転 写因子であるaryl hydrocarbon receptor (AhR)を介して引き起こされるとされている2）が，
毒性の 発現機構の詳細は未だ不明な点が多い． LiverXreceptor (LXR)は核内受容体スーパ ーファ ミリーに 属し，コレ ステロー ルの代謝物であるオキシステロールによって活性化さ れ る．LXRはコ レ ス テロ ー ルの 代 謝， 輸送およ び排泄に 関わる遺 伝子の転写 を調節し ， 生 体内 で コレ ス テ ロー ル セン サ ー の役割を 担ってい る．近年 ，PAH類などの りガンド に よって 活性化さ れたAhRはestrogen receptorおよびperoxisome proliferators‑activated receptoraなどの 核内受容 体に対して 抑制的に 働くこと が報告さ れてきている．そこで本 研 究 で はPAH類 が コ レ ス テ ロ ー ル の ホ メ オ ス タ シ ス に 重 要 な 役 割 を 担 う 核内 受 容体 LXRを介 し たシ グ ナ ル伝 達 経路 に 与 える 影 響 に着 目 し，PAH類 が誘発 するアテロ ーム性 動脈硬化の発症機構を分子レベルで解明することを目的とした．
(1)PAH類 がLXRを 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 与 え る 影 響
PAH類 の ー っ で あ るMCが コ レ ス テ ロ ー ル の ホ メ オ ス タ シ ス に 重 要 で あ る 核 内 受 容 体LXRを 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 及 ば す 影 響 を 検討 す る こと を 目的 と し ，PAH類 が 引 き 起 こす ア テロー ム性の動 脈硬化の 原因とな りうるか 検討を行 った．ヒト 肝がん由 来 HepG2細 胞 に お い てLXR標 的 遺 伝 子 で あ るATP binding cassette (ABC) Alお よ ぴ sterol regulatory element bindmgprotein‐1c（SREBP‐1c）のmRNAの発現はLXRリガンド で あ るT1317に よ っ て 誘 導 さ れ ， 典 型 的 なPAH類 で あ るMCと の 共 処 置 に よ っ て 抑 制 さ れ る こ と を 見 出 し た ． ま たSREBP‐1c標 的 遺 伝 子 で あるfattyacidsynthaseお よ び stearoylICOAdesaturaseのm心 峨 の 発 現 も ま たT1317によ り 誘 導さ れ ，MCと の共 処 置 に よ っ て 抑 制 さ れ る こ と も 見 出 し た ． さ ら にLXRお よ びSREBP‐1cを 介 し た 転 写 が MCに よっ て 抑 制さ れ るこ と ， この 転 写活 性 の 抑制 に は鉗 水 が 関与 す る ことを レポータ ―266ー
ー ジー ンアッ セイ によ り明 らか にし た． LXR 標 的遺 伝子 には コレ ステ ロー ルの 排泄およ び 代謝 に関わ る遺 伝子 が， SREBP‑lc 標的 遺伝 子に はコレステロールの解毒に関わる遺伝 子 が 存 在 す る た め PAH 類 に よ る こ れ ら の 遺 伝 子 の 発 現の 抑制 がア テロ ーム性 動脈 硬化 の 原因 のーっ にな るこ とが 考え られ た．
(2)PAH 類 に よ る LXR シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 抑 制 に お け る CYPIA1 の 役 割
PAH類によ ってAhRを介して誘導されたcytochrome P450 (CYP) 1A1がPAH類に
よ るLXRを 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 抑 制 作 用 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る の で は な い か と 予 想 し ， こ の 仮 説 を 検 証 す る こ と を 目 的 と し た ．LXRを 介 し た 転 写 が CYPに よ っ て代謝を受 けるAhRリガンドであるPAH類 ，MCおよびB[a]Pによって抑 制される
が ， 一 方 でCYPに よ っ て 代 謝 を 受 け に く いAhRリ ガ ン ド で あ るhalogenated aromatic hydrocarbon類，2，3，7，8ーtetrachlorodibenzo‑p‑dioxinおよぴ3，4，3 ，4．‑tetrachlorobiphenylによ っ て は 抑 制 さ れ な い こ と を レ ポ ー タ ー ジ ー ン ア ッ セ イ に よ っ て 証 明 し た ． ま たCYPIA1 の 阻 害 剤 を 処 置 し たHepG2細 胞 ， お よ びCYPIA1に 対 す るshort interference (si) RNA を発現させ てCYPIA1の機能を低下させたHepG2細胞においてはMCによ ってLXR
を 介 し た 転 写 は 抑 制 さ れ な い こ と を レ ポ ー タ ー ジ ー ン ア ッ セ イ に よ り 明 ら か に し た ． さ ら にCYPIA1に 対するsiRNAを発現させたHepG2細胞においてはLXR標的遺 伝子で
あるABCA1お よびSREBP‑lcのmRNAの発現 はMCによって抑制されないこ とを
見 出 し た ． 以 上 の 結 果 か ら PAH類 に よ る AhRの 活 性 化 で は な く ， CYPIA1に よ る PAH 類 の 代 謝 的 な 活 性 化 が PAH類 に よ る LXRを 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 抑 制 に 重 要 と な る こ と が 示 唆 さ れ た ． し た が っ て ，PAH類 が 誘 発 す る ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 に お い て AhRよりもCYPIA1がより直接的に関与す ることが考えられた．
(3) が ん 抑 制 遺 伝 子 p53 の 活 性 化 を 介 し た LXR シ グ ナル 伝 達 経 路 の 抑 制
PAH 類 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ た DNA 損 傷 に よ っ て 活 性 化 さ れ た p53 が 他 の 核 内 受
容 体と 同様 にLXR シ グナ ル伝 達経路 を抑 制す るの では ない かと いう 仮説 を立 て， 本仮 説
を 検 証 す る こ と を 目 的 と し た ． LXR を 介 し た 転 写 が 野 生 型 p53 を 発 現 す る HepG2 細 胞
で は p53 の 活 性 化 剤 で あ る doxorubicin (Dox) に よっ て抑 制さ れる こと をレ ポー ター ジ
ー ン ア ッ セ イ に よ り 見 出 し た ． 野 生 型 p53 を 欠 損 す る Hep3B 細 胞 で は MC に よ っ て
LXR を 介 し た 転 写 は 抑 制 さ れ な い が ， 野 生 型 p53 を 発 現 さ せ た 場 合 ， LXR を 介 し た 転
写 が抑 制さ れる こと をレ ポー ター ジー ンア ッセ イに より 明らか にし た． HepG2 細 胞に お
い て は LXR の 標 的 遺 伝 子 で あ る ABCA1 の mI 斟 A の 発 現 は Dox に よ っ て 抑 制 さ れ
る こ と を 見 出 し た ． HepG2 細 胞 に お い て は MC お よ ぴ Dox に よ っ て LXR の へ テ ロ 二
量体パートナーであるretinoidXreceptor （恥（R ）の核内における発現が抑制されることを
見 出 し た ． さ ら に MC に よ る 核 内 RXR の 発 現 量 の 抑 制 は プ ロ テ ア ソ ー ム 阻 害 剤 MG132
に よ っ て 解 除さ れ た ． 以 上 の 結 果 か ら PAH 類 に よ っ て 活 性 化 さ れ た p53 が プ ロ テ ア ソ
−267 一
ー ムを介 した RXR タン パク 質の 分解を 促進 する こと でLXR シグナル伝達経路が抑制 さ れ ， そ の 結 果 ， ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 が 促 進 さ れ る こ と が 考 え ら れ た ．
以上，本研究によりPAH 類が誘発するアテローム性動脈硬化の発症機構の一部を解明 した．
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学位論文審査の要旨
主査 教授 有賀寛芳 副査 教授 三浦敏明
副査 教授 鎌滝哲也（高崎健康福祉大学薬学部）
副査 助教授 松本健一
学 位 論 文 題 名
多環芳香族炭化水素が誘発する アテローム性動脈硬化の発症機構
Lま豊塑！三
3‑Methylcholanthrene (MC)やbenzo[a]pyrene (B[a]P)などに代表される多環芳香族炭化水素 (PAHs)はタバコ煙，自動車の排気ガスおよぴ食 品の焼焦げに多く含まれ，生体内に取り込ま れるとアテローム性動脈硬化，胎児奇形および発がんなどの重篤な毒性を誘発することが知ら れて いる ．一 般にPAHsによ って 誘発 さ れる 毒性 はり ガン ド依 存性の転写因子であるaryl hydrocarbon receptor (AHR)を介して引き起こされるとされているが，毒性の発現機構の詳細は 未だ不明な点が多い． LiverXreceptor (LXR)は核内受容体スーパーファミリーに属し，コレス テロールの代謝物であるオキシステロールによ って活性化される．LXRはコレステロールの 代謝，輸送およぴ排泄に関わる遺伝子の転写を調節し，生体内でコレステロールセンサーの役 割を担っている，そこで本研究ではPAHsがコレ ステロールのホメオスタシスに重要な役割を 担う 核内 受容 体LXRを介 した シグ ナル 伝達経路に与える影響に着目し，PAHsが誘発するア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 の 発 症 機 構 を 分 子 レ ベ ル で 解 明 す る こ と を 目 的 と し た ．
！：PAHsがI」X竪萱企k童2Z士坐伝達経墮！三皇童釜髭饗
PAHsがLXRを 介し たシ グナ ル伝 達経 路に 与え る影 響を 検討 する ために，LXRのりガンド で あ るTOー901317 (T1317)お よ び 代 表 的 なPAHsの1っ で あ るMCで 処置 した ヒト 肝が ん 由来HepG2細胞 を使 い，IヌRによ って 発現を調節され るコレステロールの排泄に関与する トランスポーターであるArPbindmgcaSse他（ABC）A1，脂肪酸の生合成を調 節する転写因子 であるsterolregulatoづelementbmdmgprote血1c（SREBP‐1c），および脂肪酸の合成，伸長反応 を触媒し，遊離コレステロールの解毒に関与するfa町acidsynmase（FAS）およぴstearoyl‐COA desaturase（SCD） のmRNA発 現量 を定 量的 リ アル タイ ムPCRに よっ て定 量 した ．T1317処 置に よっ て誘 導さ れたL）凪 によ って 発現が制御され る遺伝子であるABCA1，SREBP―1c，
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FASお よ びSCDの 発 現 はMCに よ っ て 濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ た ． 次 にMCに よ る こ れ ら LXR標 的遺 伝 子の 発現 の抑 制がLXRを介 し た遺 伝子 の転 写活 性化 を抑制することに起因す るか否か検討を行う ためにレポータージーンアッセイを行った．T1317処置によって誘導され た ルシ フェ ラーゼ活性はMCによって濃度依存的に抑制 された(data not shown).そ こでRNA 干 渉 法 を 用 い てAHRを ノ ッ ク ダ ウ ン さ せ たHepG2細 胞 を 用 い てMCがLXRを 介 し た 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 に 及 ば す 影 響 を 検 討 し た と こ ろ ，MCに よ っ て 引 き 起 こ さ れ た p(LXRE)2‑TK‑Lucで見られるルシフェラーゼ活性の抑制効果は完全に消失した．以上のことか らPAHsはAHRを 介 し てLXR標 的 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 を 抑 制 し ， そ の 発 現 を 抑 制 す る こ とが示唆された．
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AHRの り ガ ン ド で あ り CYPIA1に よ っ て 代 謝 を 受 け るPAHsお よ ぴAHRの り ガ ン ド で あ る がCYPIA1に 代 謝 さ れ に く い ハ ロ ゲ ン 化 炭 化 水 素(HAHs)が LXRを 介 し た 遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た ．PAHsで あ るMCま た はB[a]PとT1317で HepG2細 胞 を 共 処 置 し た 場 合 ，pOXRE）2可K一Lucで 見 ら れ る ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 はT1317単 独 で 処 置 した場 合と比 較し て約40か ら50ワ 。まで 抑制さ れた． 一方 ，HAHsで ある
2，3，7，8−tetrach亅0rodibenzoヤ―dioxmまたは3，4，3．，4￣‐tetracblorobiphenylとT1317でHepG2細胞 を 共 処 置 し た 場 合 ， ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 は 抑 制 さ れ な か っ た ， 次 にCYPlAlに 対 す るsi恥n を 発 現 さ せ た 場 合 ，MCに よ っ て 引 き 起 こ さ れ るp（LXI岨 ）2―TK・Lucで 見 ら れ る ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 の 抑 制 は 完 全 に 消 失 し た ． ま たAHRに 対 す る siRNAを 発 現 さ せ たHepG2細 胞 に CYPlA1を 強 制 発 現 さ せ た 場 合 ，MCは ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 を 抑 制 し た ． 以 上 の こ と か ら PAHsに よ るLXRシ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 抑 制 に は 自 身 に よ っ て 誘 導 さ れ たCYPlA1に よ る 代 謝的な 活性化 が重 要であ る可能 性が示 唆さ れた．
！：埜＆抽制遺伝 壬p53堕萱性f童企k塗LXRシグj‑坐伝達経墮c麹J
p53の 活性 化がLXRシグ ナル 伝達 経 路を抑制するか 否か検討するために，p53の 活性化剤 で あ るdoxorubicin (Dox)のLXRを介 した 転写 活性 に及 ばす 影響 をp(LXRE)2‑TK‑Lucを用 い て検 討し た．T1317処置によって誘導されたルシフ ェラーゼ活性はDoxとの共処 置で濃度 依 存 的 に 抑 制 さ れ た ． し た が っ てPAHsに よるLXRシグ ナル 伝達 経路 の 抑制 にお いてp53 の 活性 化が 重要 に詮 る可 能性 が示 唆 され た， そこ でp53が 核内 受 容体LXRおよび へテロ二 量体のパートナー であるRXRタンパク質の分解 を促進するか否か検討するために，ウエスタ ン プ ロ ッ ト 法 に よ り 核 内 に お け るLXRお よびRXRの 発現 量を 確認 した ．MCでO，6，12お よ び24時 間 ま たDoxで24時 間 処 置 し たHepG2細 胞 で は ， リ ン 酸 化p53お よ びp53の 典 型 的 な 標 的 遺 伝 子 で あ るp21の 発 現 量 はMC処 置6，12お よ ぴ24時 間 後 で 増 加 し た ． LXRの 発 現 量 はMCに よ っ て 影 響 を 受 け な か っ た がRXRの 発 現 量 はMC処 置12お よ び 24時 間 後 で 減 少 し た ．HepG2細 胞 をDoxで 処 置 し た 場 合 に お い てもLXRの 発現 量は 影響 を 受 け な ぃ も の のRXRの 発 現 量 は 減 少 し た ． 以 上 の こ と か ら 活 性化 され たp53はLXRの へ テロ 二量 体の パー トナ ーで あるRXRの 発現 を抑 制し ，LXRを介 したシグナル伝 達経路を 抑制することが示 唆された．
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このように、岩野俊介は精力的に多環芳香族炭化水素の毒性発現機能解析を行なぃ、多く の成果をあげた。これらの業績は岩野俊介に博士（薬学）の学位授与に十分値し、推薦する ものである。
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