博士 （薬 学）坂 学 位 論文 題 名
原索動物ホヤ類の卵黄膜上の精子レセプターの 構造と機能に関する研究
学位論文内容の要旨
雌雄 同体 で ある マポ ヤ(llalocynthia roretzbや カタ ユ ウレ イボ ヤ（Ciona intestinalis)など多くのホヤ類は、自家不和合性を示す。この自家不和合性は、
精子と卵 黄膜の間の自己非自己認識 機構に基づいていることが、明らかとなって いる。ま た、マボヤの自家不和合性 は、卵成熟段階で獲得され、酸処理により消 失 する こと が 分か って いる 。 そし て、 分子 量約70kDaのマボヤ 卵黄膜夕ンパク 質HrVC70は 、 卵成 熟過 程で 卵 黄膜 にお ける 含有 量 が増 加す るこ と、 な らびに 酸処理に よって卵黄膜から遊離する ことが見いだされてきた。以上のことから、
HrVC70がマ ポ ヤの 自家 不和合性に関 与している可能性が考えら れた。しかし、
HrVC70がマ ポ ヤの 受精 に関 与 する 直接 的な 証拠 は 得ら れて いな かっ た 。そこ で 、 最 初 に 抗HrVC70抗 体 を 用 い て 、 受 精 阻 害 実 験を 行っ た。 そ の結 果、 抗 HrVC70抗体 に よっ てマ ボヤの受精が 阻害されることが明らかと なった。次に、
HrVC70を アガロースビーズに固定化し、アガロースピーズに結合する自己と；I： 自 己の 精子 の 数を 調べ た。その結果 、自己の精子よりも、非自 己の精子の方が HrVC70に多 く 結合 する ことが明らか となった。また、受精時に 精子を自己ある い は 非 自 己 のHrVC70で 前 処 理 す る と 、 自 己 のHrVC70で処 理し た 精子 より も 非 自己 のHrVC70で 処理 した精子の方 が、受精率が低下すること を見いだした。
こ れら の結 果 は、HrVC70がマポヤの 受精において、自己と非自 己の精子を直接 識別して いることを示している。
HrVC70は、現在までマポヤ以外の 生物では見っかっていなかった。そのため、
HrVC70の自 家 不和 合性 における一般 性を検証するために、マボ ヤ以外のホヤ類 に お い てHrVC70ホ モ 口 グ を 探 索 す る こ と に し た 。 そ こ で 、 マ ボ ヤ と 同 じ 脇ん印ユ 必ぬ属で、進化的に最も近 いと考えられているアカボヤに着目し、アカ ボヤの受 精における自家不和合性と それに関与する分子について調べた。その結 果、アカ ポヤはマポヤの場合と同様 に、極めて厳格な自家不和合性を示すことが 明らかと なった。また、アカポヤの 自家不和合性は、卵成熟段階で獲得され、酸 処理によ って消失することも明らか となった。これらの結果は、アカポヤもマボ ヤの場合 と同様の自家不和合性の機 構を有することを示唆している。次に、アカ ポ ヤの 未成 熟 卵と 成熟 卵の 卵 黄膜 成分 をSDS￣PAGEにより比較 したところ、分 子 量 約80kDaの タ ン パ ク質 （HaVC80） が、 未成 熟 卵と 比較 して 成 熟卵 の卵 黄 膜 に非 常に 多 く存 在す るこ と が判 明し た。 さら に 、こ のHaVC80は、 卵 黄膜を 酸 処理 する こ とに よっ て遊 離 する こと も明 らか と なっ た。 これ らのHaVC80に 関 する 結果 は 、マ ポヤ にお け るHrVC70の場 合と 類 似し てい る。 また 、HaVC80 のN末 端 ア ミ ノ 酸20残 基 の 配 列 を 解 析 し た 結 果 、HaVC80がHrVC70の ホ モ 口グタン パク質であることが明らか となった。以上の事実から、アカボヤの受精 に お い て は 、HaVC80が 、 マ ボ ヤ の 受 精 に お け るHrVC70の 場合 と 同様 の役 割 を担って いると考えられる。
HrVC70は 、 前 駆 体 夕ン パク 質HrVC120の プ口 セ シン グに より 生 成す るこ と
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皿正日
が明らかとなっている。そこで、HaVC80にも前駆体夕ンパク質が存在すると 考え、アカボヤ生殖巣cDNAライブラリーからHa'V C80前駆体遺伝子のク□ー ニングを行った。クローニングの結果、単離されたク口ーンは3，726塩基からな り、そのオープンルーディングフレームは1．208アミノ酸をコードすることが明 らか、となった。このHaVC130と名付けた遺伝子産物は、N末端側から、シグナ ル配列、14回のEGF様繰り返し配列、哺乳類の卵透明帯にみられるZPドメイ ン、そしてC末端側に1回膜貫通ドメインを有している。HaVC130は、HrVC120 と83.4％ と非常に高い相同性を示すが、HrVC120の場合の13回よりも1回多 い14回のEGF様繰り返し配列を有する点において、特徴的な違いが見られた。
さらに、各組織におけるHaVC130遺伝子の発現量をノーザンブ口ッ卜解析によ って調べたところ、HaVC130遺伝子は生殖巣に極めて特異的に発現しているこ とが明らかになった。以上の結果は、HaVC80が受精に深く関わる因子である ことを示唆している。
HrVC70マボヤの自家不和合性にそれぞれ関与することから、これらのアミノ 酸配列が個体間で異なっている可能性が考えられる。そこで、9個体のマボヤの 生 殖巣 か らmRNAを 調製 し、RTPCR法に よってHrVC70領 域を増 幅して、 側 体間の配列を解析した。その結果、HrVC70は個体ごとで数力所のアミノ酸越換 が起こっていることが明らかとなった。また、5個体のアカボヤの生殖巣から、
HaVC80領域 について 個体間 の配列を 解析することによって、HaVC80の分r 多型についても検討した。その結果、HrVC70、HaVC80共に個体ごとに配列が 異なることが判明した。多型領域が、EGF様ドメインの第3Cysと第4Cysの問、
な らび にEGF様 ド メ イン 連結部分 に見ら れる点は 、HrVC70とHaVC80の 場 合で同じであったが、EGF領域の第lCysと第2Cysの間にもアミノ酸置換が多 く起こっている点は、HaVC80の場合にのみ見られる特徴であった。EGF様繰 り返し配列をもつ分子においては、1残基のアミノ酸の違いが分子間認識に犬き な影響を与えることカミ、膜夕ンパク質であるNotchやDeltaなどでよく知られ ている 。以上 の事実は、HrVC70とHaVC80が個体間の認識に関わっているこ との構 造的支 持を与えている。また、HrVC70とHaVC80では、その分子認識 機構が多少異なる可能性が考えられる。
HaVC130とHrVC120との間に 非常に高 い相同 性が見ら れるに もかかわら ず、EGF様繰り返し配列の回数が異なることは、分子進化や種分化の観点から 非常に 興味深 い。そこで、HaVC130のゲノムDNA配列を決定し、すでに明ら か に な っ て い るHrVC120の ゲ ノ ムDNA配 列 と 比 較 す る こ と に よ り 、 HrVC120／HaVC130遺 伝子の 分子進化 について考察した。決定したDNA配列 から、HaVC130ゲノムDNAは5，494塩基からなり、23個のエキソンにより構 成され ている ことが明らかになった。さらに、HrVC130とHrVC120のゲノム DNA配列を比較した結果から、（1）元来6個のEGF様繰り返し構造からなるプ ロトタイプのVC70′80様夕ンパク質が存在し、（2）その5番目と6番目のEGF 様領域が1つのセットとなって重複を繰り返すことによって、12個のEGF様繰 り返し 構造か らなるHrVC70が生成し 、さらに、（3）HrVC70の8番目のEGF 様ドメ インがHaVC80の8，9番 のEGF様 ドメインに重複することによって、
HaVC80が 生 成 し た と い う 分 子 進 化 に 関 す る 仮 説 を 提 案 し た 。 今後、本研究により解明された精子レセプターと類似の分子が、哺乳類の受精 においても重要な機能を果たしているかについて検討することも今後の重要な 課題である。
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学位論文審査の要旨 主査 教 授 横沢 英良 副査 教 授 澤田 均 副査 助教授 松本健一 副査 助教授 川原裕之
学 位 論 文 題 名
原索動物ホヤ類の卵黄膜上の精子レセプターの 構造と機能に関する研究
原索動物ホヤ類に属するマボヤ(llalocynthia zoretzjr)は、雌雄同体にもかかわら ず、受精における自家不和合性を示す。この自家不和合性は、卵を取り巻く卵黄膜と 精子との間の自己と非自己の認識に基づぃている。古くから、マポヤの自家不和合性 は卵成熟段階で獲得され、卵黄膜の酸処理により消失することが明らかにされていた が、 最近、 マボヤ卵 黄膜上に 存在す る精子レ セプタ ーHrVC70蛋白 質（分子 量約70 kDa)が、 卵成熟 過程で含 有量が増加することや酸処理により卵黄膜から遊離するこ とか ら、マ ポヤの受 精におけ る自家不和合性に関与する可能性が提唱されている。
本論 文提出 者は、マ ポヤ及び、マポヤと進化的に近いと考えられているアカボヤ (llalocynthia aura皿 ガH閲）に着 目し、 マボヤHr1ゾC70及びアカポヤHrVC70ホモ 口 グ （HaVC80） の 受 精 に お け る自 家 不 和合 性 へ の関 与 、HrVC70及 びHaVC80の 個 体 レベ ル で の分 子 多 型、HaVC80前駆 体蛋白 質HaVC130の ドメイ ン構造と ゲノム 構造 、さら に、H1ヅC70及びHa丶′C80の分子進化に関する一連の研究を展開し、以 下の成果をおさめた。
（1）抗HrVC70抗体 を 用 い てマボヤ の受精阻 害実験 を行い、 この抗 体によル マボ ヤの 受精が 阻害され ること、 アガロ ースビー ズに固 定化したHrVC70に、自 己の精 子よ りも非 自己の精 子の方が 多く結 合するこ と、さ らに、自 己のHrVC70で 前処理 した 精子よ りも、非 自己のHrVC70で前処理 した精 子の方が 、マポ ヤの受精 率が低 下す ること を明らか にし、マ ポヤの受精において、HrVC70が自己と非自己の精子を 直接識別していると結論した。
（2）自家不和合性を示すマポヤに進化的に近いと考えられているアカボヤが、極め
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て厳格な自家不和合性を示すこと、その自家不和合性は卵成熟段階で獲得され、卵黄 丁
膜の酸処理によって消失することを明らかにした。さらに、アカポヤの場合は、分子 量 約80 kDaの 蛋白質(HaVC80)が、未成 熟卵と 比較して 成熟卵 の卵黄膜 に非常に 多 く 存 在す る こ と、HaVC80が 卵黄 膜 の 酸処 理 で 遊離 す ること を明ら かにし、
HaVC80が アカ ボ ヤ の 受精 に お ける 自 家 不和 合 性 に関 与 してい ると推 論した。
（3） ア カ ボ ヤ 生 殖 巣cDNAラ イ ブ ラ リ ー を 用 い て 、HaVC80前駆 体 蛋 白質 (HaVC130)のcDNAク 口 ー ニ ン グ を 行 い 、HaVC130のド メ イ ン構 造(N末端 側 から、 シグナ ル配列、14回のEGF様繰り 返し配 列、哺乳 類の卵透明帯にみられる ZPドメ イン、そ して1回膜貫 通ドメインからなる）を明らかにした。HaVC130は、
マ ポ ヤHrVC70前 駆 体 蛋白 質HFゾC120と 非常に 高い相同 性を示 すが、13回 のEGF 様 繰 り 返し 配 列 を有 す るHrVC120と比 較して 、1回 多いEGF様繰り 返し配列 を有 することが特徴である。さらに、9個体のマボヤ生殖巣及び5個体のアカボヤ生殖巣 を 用 い て 、 それ ぞ れHrVC70領 域 及 びHaVC80領 域をRTPCR法 によ り 増 幅し 、 個 体間の アミノ 酸配列を 解析・ 比較して 、HFゾC70とHaVC80の両者ともに、個体ご とに特定の領域におけるアミノ酸配列が異なることを明らかにし、この分子多型が受 精における自家不和合性を規定していると推論した。
（4）HaVC130の ゲノ ムDNA配 列 を 決定 し 、HrVC120の ゲノ ムDNA配 列 と 比較 することにより、HrVC70／HaVC80の分子進化に関する仮説を提案した。すなわち、
はじめ に6個のEGF様繰り 返し構造からなるプ口トタイプが存在し、進化の進行に 伴 って、 プ口卜 夕イプの5番 目と6番目のEGF様領 域が1つのセッ トとな って重複 を 繰 り 返す こ と によ り 、12個 のEGF様繰り返 し構造 からなるHrvC70が生成 し、
さ ら に 進 化 が 進 み 、HrVC70の8番 目 のEGF様 ド メイ ン がHaVC80の8、9番 目 の EGF様ド メイン に重複す ること によって 、13個のE（酒 様繰り返 し構造 からなる HaVC80が生成したという仮説である。
以上の新知見およびそれらを得るために用いた新研究方法は、ホヤ類の受精におけ る自己非自己認識機構の理解にとどまらず、広く他の生物での受精や細胞間認識にお け る 自 己 非 自 己 認 識 機 構 を 理 解 す る 上 で 重 要 な 寄 与 を な す も の で あ る 。 審査委員一同このことを高く評価し、本論文提出者が博士（薬学）の称号を受ける にふさわしいものと一致して判断した。
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