博士（医学） 野村友希子 学位論文題名
日本人慢性膿皮症患者におけるソ・セクレターゼ遺伝子変異
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
【背景と目的】
慢性膿皮症は毛包を中心とする皮膚付属器から発症する遷延性の化膿性炎症であり、毛包脂腺系 において角栓形成による毛包閉塞が生じた結果、毛包・脂腺・アポクリン腺の分泌・代謝物が貯 留し、これに二次的な細菌感染や異物反応が加わって難治性の瘻孔が形成される。一般的には再 燃を繰り返すうちに難治性となり、患部に瘢痕と瘻孔の形成を繰り返すため、患者に整容面での 多大な苦痛を与えるだけでなく、慢性膿皮症を発生母地として皮膚有棘細胞癌が発症することが ある。本症の病因は長らく不明であったが、その発症には宿主側の要因が深く関係しており、約 30% の症例で、常染色体優性遺伝の症例が報告されていた（家族性慢性膿皮症）。2010 年、家族性 慢性膿皮症の原因遺伝子が膜貫通タンパクの一種であるv セクレターゼをコードする遺伝子であ ることが明らかになり、その後、中国やイギリスから相次いで家族性慢性膿皮症における v セク レターゼの遺伝子変異が報告された。ッセクレターゼはpresenilin 、nicastrin 、presenilin enhancer − 2 、 anterior pharynx defectivel の4 つのサブュニットで構成されており、それらは それぞれ PSEN1 、PSEN2NCSTN. PSENEN. APHIA 、APHIB という6 つの遺伝子でコードされている。
本研究の目的は、家族性及ぴ孤発性慢性膿皮症の日本人患者におけるッ―セクレターゼ遺伝子変異 の有無を同定することである。
【材料と方法】
材料：日本人家族性慢性膿皮症患者11 家系、孤発性慢性膿皮症患者21 人、一般コントロール50 人。
方法：＠患者、及びその家族の末梢血または唾液からDNA を抽出し、ッ―セクレターゼを構成する 6 つの遺伝子：PSEN1 丶PSEN2. NCSTN. PSENEN. APHIA 、APHIB のエクソン及びエクソンーイントロ ン境界部のシークエンスを行った。
◎ lVCSTN の変異を認めた1 家系目の家族性慢性膿皮症患者の末梢血からmRNA を抽出し、real time RT ―PCR を行い、その発現量を正常コントロールと比較した。
◎抽出したmRNA を cDNA へと変換し、TA クローニングを行い、どのようなスプライシングが起こ っているかをシークエンスで確認した。
【結果】
＠ッーセクレターゼ遺伝子変異検索
家族性慢性膿皮症家系：日本人家族性慢性膿皮症11 家系において、2 家系でv ーセクレターゼ を構成する遺伝子のーっで あるNCSTN にそれぞれc ． 582+ldelG のスプライシング変異及び
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p． Gln568Termの ナ ン セ ン ス 変 異 を ヘ テ ロ 接 合 性 に 認 め た 。
孤 発 性 慢 性 膿 皮 症 ： 孤 発 性 慢 性 膿 皮 症 患 者 で は1名 でPSEN2の エ ク ソ ン13にp．Thr421Metの ミ ス セ ン ス 変 異 を ヘ テ ロ 接 合 性 に 認 め た 。 そ の 他 の 患 者 で は6つ の 遺 伝 子 に 変 異 を 認 め な か っ た 。
＠NCSTN mRNA発 現 量 の 比 較 ： リ ア ル タ イ ムRT―PCRに てAぬ 刪mRNA発 現 量 の 比 較 を 行 っ た と こ ろ 、 怩 ゴm′ にc．582十1delGの 遺 伝 子 変 異 を 持 つ 発 端 者 で は 、正 常コ ン トロ ール と 比較 して そ の 発 現 量 が 有 意 に 低 下 し て い た 。
◎ ス プ ラ イ シ ン グ の 検 討 ： 正 常 コ ン ト ロ ー ル で は 朋 鴛7Wの エ ク ソ ン5か ら エ ク ソ ン6へ の ス プ ラ イ シ ン グ の み を 認 め た 。 一 方 、 惚 ゴmHこc．582十ldelGの 遺 伝 子 変 異 を 持 つ 発 端 者で はエ ク ソ ン5か ら エ ク ソ ン6へ の 正 常 な ス プ ラ イ シ ン グ が あ る 一 方 で 、 エ ク ソ ン5か ら エ ク ソ ン7、 エ ク ソ ン5か ら エ ク ソ ン9へ の 異 常 な ス プ ラ イ シ ン グ 産 物 を 認 め た 。
【 考 察 】
ッ ー セ ク レ タ ー ゼ 遺 伝 子 変 異 検 索 ： 今 回 、 日 本 人 家 族 性 慢 性 膿 皮 症2家 系 で ッ ー セ ク レ タ ー ゼ を 構 成 す る 遺 伝 子 の ー っ で あ る ＾Eゞ 刪 に 新 規 変 異 、c．582十1delG及 びp．Gln568Termを 同 定 し た 。 c．582十ldelGを 持 つ1家 系 目 で は こ れ ま で の 報 告 と 同 様 、 同 じ 変 異 を 持 っ て い て も 臨 床 症 状 の 重 症 度 は 異 な っ て い た 。 さ ら にp．Gln568Termの 変 異 を 認 め た2家 系 目 で は 、 同 じmさ 刀Vの ナ ン セ ン ス 変 異 を 持 ち な が ら も 、 同 一 家 系 内 に 慢 性 膿 皮 症 の 症 状 を 持 っ 個 体 と 全 く 慢 性 膿 皮 症 の 症 状 を 持 た な い 個 体 が い る こ と が 判 明 し た 。 肥 満 、 喫 煙 な ど の ッ ー セ ク レ タ ー ゼ 遺 伝 子 変 異 以 外 の 要 因 が そ の 重 症 度 に 大 き く 関 わ っ て い る と 考 え ら れ た 。 孤 発 性 慢 性 膿 皮 症 患 者 で は 、 ッ ― セ ク レ タ ー ゼ を 構 成 す る6つ の 遺 伝 子 に は 、 明 ら か な 機 能 喪 失 変 異 を 認 め な か っ た 。1名 で 鬥 ； 倒 ぽ の エ ク ソ ン13に p．Thr421Metの ミ ス セ ン ス 変 異 を ヘ テ ロ 接 合 性 に 認 め た が 、 慢 性 膿 皮 症 発 症 と の 関 連 は 不 明 で あ っ た 。
彫 閉WmRNA発 現 量 の 比 較 ： ＾ ぞ ゴmHこc．582十1delGの ス プ ラ イ シ ン グ 変 異 を へ テ ロ 接 合 性 に 持 っ た 発 端 者 で は 、 正 常 コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て そ のmRNA発 現 量 が 約30％ 程 度 ま で 低 下 し て い た 。 こ れ は 、 変 異 を も っ たmRNAが ナ ン セ ン ス 変 異 依 存mRNA分 解 機 構 に よ っ て 細 胞 内 で 分 解 さ れ た 結 果 で あ る と 考 え た 。
ス プ ラ イ シ ン グ の 検 討 ： 朋 蔦7Wエ ク ソ ン5か ら エ ク ソ ン7の ス プ ラ イ シ ン グ 産 物 に 関 し て は 早 期 終 止 コ ド ン が 生 じ て い た こ と か ら 、 生 体 内 で は 変 異 を も っ たmRNAが ナ ン セ ン ス 変 異 依 存mRNA分 解 機 構 に よ っ て 細 胞 内 で 分 解 さ れ る と 考 え ら れ た 。 エ ク ソ ン5か ら エ ク ソ ン9へ の ス プ ラ イ シ ン グ に 関 し て は イ ン フ レ ー ム の 変 異 で あ り 、 明 ら か な 早 期 終 止 コ ド ン を 確 認 す る こ と が で き な か っ た 。 し か し 、 膨 ： ゴ 刪 の ミ ス セ ン ス 変 異 が 機 能 喪 失 変 異 で あ る と 推 測 さ れ て い る こ と を 照 ら し 合 わ せ る と 、 こ の 異 常 な ス プ ラ イ シ ン グ 産 物 も エ ク ソ ン6か ら8が コ ー ド す る ア ミ ノ 酸 の 欠 失 に よ り v− セ ク レ タ ー ゼ 活 性 が 低 下 し て い る 可 能 性 が 高 い と 推 測 し た 。
【 結 諭 】
日 本 人 家 族 性 慢 性 膿 皮 症 家 系 に お い て 、v― セ ク レ タ ー ゼ を 構 成 す る 遺 伝 子 の ー っ で あ る＾Eゞm′ に 新 規 の ス プ ラ イ シ ン グ 変 異 及 び ナ ン セ ン ス 変 異 を 同 定 し た 。 本 研 究 に よ り 、 日 本 人 で もvー セ ク レ タ ー ゼ の 遺 伝 子 変 異 は 慢 性 膿 皮 症 発 症 に 深 く か か わ っ て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。 一 方 、 孤 発 性 慢 性 膿 皮 症 患 者 で は 、 明 ら か な 機 能 喪 失 遺 伝 子 変 異 は 認 め ら れ な か っ た 。v― セ ク レ タ ー ゼ 遺 伝 子 変 異 以 外 に も 喫 煙 、 肥 満 な ど の 外 的 要 因 が 慢 性 膿 皮 症 の 発 症 と 重 症 度 に 大 き く 関 係 し て い る 可 能 性 が 明 ら か に な っ た 。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
学 位 論 文 題 名
日本人慢性膿皮症患者におけるソ・セクレターゼ遺伝子変異
審査会では、申請者より「日本人慢性膿皮症患者におけるッーセクレターゼ遺伝子変異に関する研 究」について発表された。近年、家族性慢性膿皮症の原因遺伝子がv −セクレターゼを構成する遺 伝子であることが国外から報告されたが、今回申請者は、日本人家族性慢性膿皮症11 家系中2 家 系でッ―セクレターゼを構成する遺伝子であるtVCSTN に新規のスプライシング変異及びナンセン ス変異を同定し、日本人においても同遺伝子が本症の病因のーっであることを示した。スプライ シング変異を持つ1 家系目においては、その変異を持つ患者でcVCSTN のmRNA が低下しており、
cDNA からのスプライシングの検討により、異常スプライシング産物があることが示された。2 家 系目においては、ナンセンス変異が慢性膿皮症の症状を持つ発端者、その兄、そして慢性膿皮症 の症状を持たなぃその姉に認められた。日本人孤発性慢性膿皮症患者21 例では、ッ―セクレター ゼのフレームシフト変異、スプライシング変異およびナンセンス変異はいずれも認められなかっ た。1 例のみ、PSEN2 にミスセンス変異を認めたが、その変異がその患者の慢性膿皮症の原因で ある可能性は低いと結論づけられた。これらの結果から、日本人家族性慢性膿皮症の発症にもv
−セクレターゼ遺伝子変異が関与していることが示されたが、その一方で、v −セクレターゼ遺伝 子変異を認めない症例も多く、それ以外の遺伝子変異が関与している可能性も示唆された。また、
慢性膿皮症の孤発例の発症にはッーセクレターゼ遺伝子変異が関与していないことが初めて示さ れた。変異を持つ家系の解析結果からは、慢性膿皮症の発症及び重症度には、ッーセクレターゼ 遺伝子変異以外の要因も重要であることが示された。
審査では、日本と海外での発症率に関する差について質問があり、申請者からは、ヨーロッパ では人口の1% 程度発症すると報告があり、人種間での明らかな差は報告されていないとの回答が 得られた。ッ―セクレターゼ遺伝子変異がある患者での血管形成異常などの皮膚以外の症状につい て質問があり、申請者からは、家族性慢性膿皮症1 家系目の発端者は 30 代で大腸がんを発症して
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幸 次
宏 孝
昌 鎮
壽
口 山
水 邊
野 畠
清 佐
授 授
授 授
教 教
教 教
査 査
査 査
主 副
副 副
い る も の の 、 そ れ 以 外 に 明 ら か な 異 常 は な い と の 回 答 が 得 ら れ た 。1家 系 目 で はIVCSTNの 遺 伝 子 変 異 に よ っ て 、 フ レ ー ム シ フ ト が 起 こ る の か と の 質 問 が あ り 、 申 請 者 か ら はcDNAを 調 べ た と こ ろ 、 ス プ ラ イ シ ン グ は 複 数 あ る が 、 少 な く と も1つ の ス プ ラ イ シ ン グ で は フ レ ー ム シ フ ト が 起 こ り 、 早 期 終 止 コ ド ン が 出 現 す る こ と を 確 認 し て い る と の 回 答 が 得 ら れ た 。 ッ ー セ ク レ タ ー ゼ 遺 伝 子 の 浸 透 率 、 保 因 者 に 関 す る 質 問 が あ り 、 申 請 者 か ら は こ れ ま で の 報 告 で は20家 系 以 上 で100%の 浸 透 率 で あ り 、 保 因 者 は い な い と 考 え ら れ て い た が 、 今 回 発 表 し た2家 系 目 で は 変 異 を も ち な が ら も 発 症 し て い な い 症 例 が 存 在 し た と の 回 答 が あ っ た 。 慢 性 膿 皮 症 と 皮 膚 有 棘 細 胞 癌 発 症 に 関 し て 、 v― セ ク レ タ ー ゼ 遺 伝 子 変 異 が あ る こ と でNotchの シ グ ナ ル が 落 ち て い る 証 拠 が あ る の か と の 指 摘 に 、 申 請 者 か ら は そ う い っ た 報 告 は な く 、 推 測 の 域 を 出 な ぃ が 、 ヒ ト の 皮 膚 有 棘 細 胞 癌 で は70%
以 上 でNotchの 遺 伝 子 変 異 を 認 め る と の 報 告 が あ る と の 回 答 が 得 ら れ た 。1家 系 目 に 関 し て 、 末 梢 血 か らmRNAを 取 り 出 し て い る が 、 慢 性 炎 症 の 影 響 は な い の か と の 指 摘 に 、 申 請 者 は 、 末 梢 血 を 採 取 し た 患 者 は す で に 植 皮 術 後 で あ り 、 現 在 症 状 が 落 ち 着 い て い る た め 、 そ の 影 響 は 少 な ぃ と 考 え ら れ る と 回 答 し た 。 ま た 、 ッ ー セ ク レ タ ー ゼ 遺 伝 子 変 異 が あ る 患 者 で は り ン パ 球 の 異 常 や サ ブ セ ッ ト の 違 い が あ る の か と の 質 問 に 、 申 請 者 か ら は サ ブ セ ッ ト に 関 し て 今 回 は 検 討 し て い な ぃ が 、 白 血 球 の 明 ら か な 異 常 は な い と の 回 答 が 得 ら れ た 。 今 回 の 遺 伝 子 変 異 が あ る こ と に よ り 、 ッ ー セ ク レ タ ー ゼ の 安 定 性 な ど が 失 わ れ る と 思 う が 、 転 写 に 関 し て は 考 え な く て よ い の か と の 指 摘 が あ り 、 申 請 者 か ら は 、 こ れ ま で の 報 告 で 行 わ れ て い る の と 同 様 の 方 法 でmRNAの 低 下 を 検 討 し た こ と が 報 告 さ れ た 。2家 系 目 で は 同 じ 変 異 を 持 っ て い て も 発 症 し て い な い 家 族 も い た が 、 そ れ を ど の よ う に 今 後 証 明 す る の か と の 質 問 に 対 し て 、 申 請 者 か ら は 、 お そ ら く50%程 度 の ッ ー セ ク レ タ ー ゼ 発 現 低 下 が 、 発 症 す る か ど う か の 分 岐 点 で あ り 、 そ れ に 肥 満 や 喫 煙 な ど の 要 素 が 加 わ る こ と で 発 症 す る の で は な ぃ か 、 そ う で あ れ ば 患 者 が 喫 煙 な ど を し な け れ ば 発 症 し な い 、 も し く は 重 症 に な ら な い 可 能 性 が あ る と 考 え て い る と の 回 答 が 得 ら れ た 。
こ の 論 文 は 、 日 本 人 家 族 性 慢 性 膿 皮 症 患 者 で も ッ ー セ ク レ タ ー ゼ 遺 伝 子 変 異 が 関 わ っ て いる こ と、
ま た そ れ 以 外 の 要 因 が 慢 性 膿 皮 症 の 発 症 及 び 重 症 度 の 決 定 に 関 与 す る こ と を 明 ら か に し た 点 で 高 く 評 価 さ れ 、 今 後 の 慢 性 膿 皮 症 予 防 な ら び に 治 療 へ の 応 用 、 開 発 が 期 待 さ れ る 。 審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。
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