博士（医学）加藤 学位論文題名
Tumor Necrosis Factor‑a の ヒト グリ オー マ細 胞 に対する増殖抑制効果にっいての研究
学位論文内容の要旨
腫 瘍 壊 死 因 子tumor necrosis factor‑ゼ （TNF） は ，1975年 ， 腫 瘍 に 出 血 壊 死 を 生 じ る 蛋 白 質 と し て 発 見 さ れ ， そ の 後 ヒFrec ombinant TNFが 開 発 さ れ 飛 躍 的 に 研 究 が 進 み ， 基 礎 ， 臨 床 と も に 数 多 く の 報 告 が み ら れ る ． ま たTNFは ， 腫 瘍 細 胞 に 対 し て 直 接 の殺細胞効 果／増殖抑 制効果を有 するサイIカイン として，癌治療 へ の 臨 床 応 用 が 期 待 さ れ て き た ． 脳 に 原 発 す る 代 表 的 悪 性 腫 瘍 で あ る 悪 性 神 経 膠 腫 に 対 す るTNFの 直 接 腫 瘍 細 胞 障 害 活 性 に 関 し て は ， 諸 家 に よ り そ の 見 解 が 異 な り 未 だ 定 説 を 見 て い な い ． 最 近 は むし ろ ，0゛ リオ ーマ細胞に 対するTNFの直接細胞 障害作用は 非常に低いという報告が多い．
と ころで，TNFのcDNAのケローニンヶ゛によってTNF受容体の構造が 解 明 さ れ ， 分 子 量 の 異 ナ ょ るp55お よ びp75と い う2種 類 の 分子 が TNF受 容 体 と し て 存 在 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た ． そ の 機 能 に つ い て は ，p55TNF受 容 体 は 機 能 的 受 容 体 で あ り ， 細 胞 致 死 活 性 な ど に 関 与 し て いる こ とが 明 らか に なっ て き てい る ． しか し な が ら ，p75TNF受 容 体 は 細 胞 致 死 活 性 に は 関 与 し て い な い と 考 え ら れ て い る が ， 本 来 の 機 能 は 依 然 不 明 な 点 が 多 い ． ま た 最 近 ，ケ゛リオ ーマ細胞でp55TNF受容体が優位に発現していたとの報告 がある．
現 在 本 邦 に お い て ， 悪 性 神 経 膠 腫 に 対 す るTNFの 臨 床 第u相 試 験 が 進 行 中 で あ る が ，TNFの 多 様 な 生 理 活 性 を う ま く 引 き 出 す こ と がで き れば そ の効果が 期待できる と思われる ． しかしナ ょ が ら ， 悪 性 神 経 膠 腫 へ の 直 接 作 用 に 関 し て は 不 明 な 点 が 多 く ， 治 療 効 果 を 高 め る た め に は ，TNFに 対 す る 感 受 性 ， 受 容 体 ， 耐 性 ， 作 用 機 序 な ど の 解 析 へ の 取 り 組 み が 重 要 で あ る と 考 え る ・ 本研究は，tトヶ゛リオ7゛ラスIーマ細胞株を用いて，2種類のTNF受容 体 の 発 現 を 解 析 し ，TNFの 直 接 腫 瘍 細 胞 障 害 ／ 増 殖 抑 制 効 果 と 細胞周期の関係からその感受性について，さらにケ゛ルオ7゛ラスI‐マ
−135 ‑
功
細 胞 の 代 謝 修 飾 と 分 化 誘 導 ナ ょ ど の 生 物 学 的 反 応 に っ い て 解 析 検 討したものである．
ケ ゛リ オ7´ うスI− マ細 胞12株 にお いて ，p55お よびp75TNF受容体の発 現 を ，PCRお よ び フ ロ ― サ イIメIリ ‐ に て 検索 し た と ころ ，す べての 細 胞 株 でp55TNF受 容 体 のRNA転 写 産 物 な ら び に 細 胞 膜 上 の 受 容 体 蛋 白 を 検 出 し た ． こ の 内 ，p75TNF受 容 体 を も 発 現 し て い た も の は 4細 胞 株 で あ っ た が ，p75TNF受 容 体 の み 発 現 し た 細 胞 は な か っ た ． こ の こ とか ら ， ケ゛ リオ7゛ ラスI‐マ 細胞 にお いて はp55TNF受 容 体 が 優 位 に 発 現 し て お り ，TNFの 作 用 発 現 に はp55TNF受 容 体 が 機能的受容体として関与していると考えられた・
次 に，ヒトケーリオフ゛ラスF‑マ細胞12株に，256 U/mlまでの低濃度TNF を 3〜7日 間 作 用 さ せ る と ，MTT試 験 で ほ と ん ど の 細 胞 株 はTNF の 殺 細 胞 効 果 に 対 し て 抵 抗 性 で あ り ， 比 較 的 良 く 反 応 し た 細 胞 株 で の 効 果 は 殺 細 胞 効 果 で は な く 増 殖 抑 制 効 果 と 考 え ら れ た ． さ ら に 低 濃 度TNFで ， 3H―thymidine取 り 込 み 試 験 で のDNA合 成 能 を 評 価 す る と ， 9細 胞 株 で 抑 制 効 果 を 認 め た ． 以 上 よ り ，TNF はヶ ゛リ オフ ゛ラ スIー マ細 胞に 対し て顕 著な 殺細 胞効 果を有 さないもの の，増殖抑制効果を示し得ることが示唆された．
TNFのケ ゛リ オ7゛ラ スIー マ細 胞に 対す る増 殖抑 制効 果の機 序を検討す る た め に ，BrdU−Pl二 重染 色法 によ るフ ロ‐ サイIメIリ‐ で細 胞周期 解 析 を 行 な う と ， G o/G】 期 細 胞 の 増 加 とS期 細 胞 の 減 少 をTNFの 濃 度依 存性に認め，このTNFの抗増殖効果の一部はケ゛リオフ゛ラストーマ細 胞 のS期 に お け るDNA合 成 が 抑 制 さ れ る こ と に よ り 生 じ る こ と が 示 さ れ た ． こ のGl期 で の 停 止 作 用 が ， 細 胞 を 分 化 の 過 程 へ と 誘 導 し た た た め か ど う か を 調 べ る た め に ，0゛ リ オ ー マ に お け る 分 化 度 の 指 標 と 考 え ら れ て い るglial fibrillary acidic protein（GF AP） 量 の 変 化 をフ ロ ー サイIメIリー で調 べた ．10 U/mlのTNF刺 激によ っ て確 かに 細胞 内のGFA蛋 白の 増加 を認 め， ケ゛ リオ7゛ラ スIー マ細胞では TNFにより分化が誘導されることが示された．
TNFの 細 胞 障 害 活 性 に お け る 作 用 機 序 は 不 明 な 点 が 多 い が ， 7うキI゛ン酸代謝におけるフォス7オリハ゜―セ゛A2の関与が指摘されている 今 回 の 実 験 結 果 か ら も ，TNFに 感 受 性 を 示 し た 細 胞 株 で はTNF処 理に より 培養 上清 中にPGE2の放出 が増加しており，フォスフォリハ．ーセ A2の 賦 活 化 を 介す る 細 胞障 害効 果が 少な くと も一 部の ヶ´ リオ フ゛ラ ス I−マ細胞においてあてはまることが示唆された．
さ ら に ，TNFの 殺 細 胞効 果に 対す るヶ゛ リオ7tラ スIーマ 細胞 の抵抗 性 の 機 序 を 解 析 す る た め に ， 細 胞 内Mn―SODを 測 定 し た ．Mn―SODは TNFに よ る 細 胞 障 害 作 用 か ら 細 胞 を 防 御 す る 防 御 蛋 白 質 と し て 注 目 さ れ て い るfree radical scavengerの ー つ で ，TNF抵 抗 性 の要 因と する 報告 もあ る．0゛リ オフ ゛ラ ス1ー マ細 胞内 のMn―SODは様々
− ．136―
な 値 を 示 し ，TNF刺 激 に よ り 濃 度 お よ び 時 間 依 存 性 にMn−SODが 誘 導 さ れ る 傾 向 が 見 ら れ た ． し か しTNF感 受 性 株 に お い てMn― SODは顕著に誘導され，Mn−SODがヶ゛リオ7゛ラスIーマにおいてTNFに対 す る 防 御 蛋 白 質 と し て 働 く 可 能 性 は 少 な い と 考 え ら れ た ・ 直 接的 な抗腫 瘍細 胞効 果と は別に ，TNFにはケ゛リオ‐マ由来の細 胞からある種のサイIカイン産生を促すことが報告されている．0゛リオ 7゛ラスIーマ細胞のサイ1カイン産生能に対するTNFの影響にっいて調べた と こ ろ ， 細 胞 障 害 作 用 を 示 さ な い 比 較 的 低 濃 度 か っ 短 時 間 のTN F作 用 に より ，IL―6，IL−8，GM−CSFの 産 生 増 加 を 認 め た ． こ の 事実はTNFの作用を考える上で非常に興味深い．ケ゛リオ7゛ラスI―マは TNFの 細 胞 障 害 活 性 に 対 し て 感 受 性 が 低 い が ， そ れ は 単 に 無 反 応であるというのではなく，0´リオフ゛ラストーマの代謝のある回路は 低 濃 度 ・ 短 時 間 のTNFに 非 常 に 敏 感 に 反 応 す る こ と を 示 し て い る ．TNFが こ れ ら の 生 理 活 性 物 質 の 産 生 を 促 す こ と1ま ，GFAP産 生量の増加と同様にケ゛リオ7゛ラスI―マ細胞の分化誘導の結果である のかもしれナょい・
前述したように，ケ゛リオ7゛うスト‐マ細胞ではp55TNF受容体が優位 で ， 機 能的 受 容 体 で あ る と 考 え られ る．p 75TNF受 容体 の機 能を 推 定 す る た め に ，.p55TNF受 容 体 単 独 とp55お よ びp75TNF受 容 体 の 両者 を発 現する 細胞 にお いて ，TNFの増殖抑制効果とサイトカイン産 生 能 に っ い て 比 較 し た が ， 明 ら か な 違 い は 見 い 出 せ ず ， 一 部 の ヶ゛リオフ´ラスI―マ細胞が発現するp75TNF受容体の機能にっいては明 らかにできなかった．
以上をまとめると，0゛リオフ゛ラスIーマ細胞はp55TNF受容体という 機 能 的 受 容 体 を 持 ち ， 低 濃 度TNFに 対 し て も 種 々 の 反 応 を 起 こ す ． そ の 作 用 は 殺 細 胞 効 果 を も た ら す よ う に は 働 か ず ， 種 々 の サイIカ イン やGFAPなど の蛋 白産 生を促すことにより細胞を分化誘導 し ， 増 殖 静 止 効 果 を も た ら す の で は な い か と い う こ と で あ る ． 悪 性 神 経 膠 腫 に 対 す るTNFの 臨 床 効 果 は 未 だ 明 瞭 で は な い が ， 本 研 究 に よ り 腫 瘍 細 胞 の 分 化 誘 導 療 法 の ー っ と し てTNFを 利 用 できる可能性が示唆された．
―137―
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Tumor Necrosis Factor‑a の ヒト グ リオ ー マ 細胞 に対する増殖抑制効果にっいての研究
腫 瘍 壊 死 因 子 tumor necrosis factor‑a（TNF） は ， そ の 主 な 作 用 と し て ， 直 接 の 腫 瘍 細 胞 に 対 す る 殺 細 胞 効 果 ／ 増 殖 抑 制 効 果 を 有 す る た め に ， 各 種 癌 疾 患 で の 報 告 の 他 ， 脳 腫 瘍 に お い て も 臨 床 試 験 が 進 行 中 で あ る ． し か し な が ら ， ヒIケ ゛ リ オ ‐ マ 細胞 の 多く はin vit roに お い てTNFの 殺 細 胞 効 果 に 対 し て 抵 抗 性 で あ る と 報 告 さ れ てい る ． 本研 究 は， ヒ10゛ リ オ7゛ うスI− マ 細胞 株 を 用い て ，2種類存 在 す るTNF受 容 体 の 発 現 を 解 析 し ， TNFの 分 化 誘 導 に よ る 増 殖 抑 制 効 果につい て検討し たもので ある．
ケ ゛ リオ7゛ ラ スF‑マ 細胞12株にお いて，p55お よびp75TNF受容体 の発現 を ，PCRお よ び7ロ ー サイIメIリ ー にて 検 索 した と ころ ， す べて の 細胞 株 でp55TNF受 容 体 を 検 出 し た ． こ の 内 ，p75TNF受 容 体 を も 発 現 し て い た も の は4細 胞 株 で あ っ た が ， p75TNF受 容 体 の み 発 現 し た 細 胞 はなかっ た． この ことから ，ケ゛リ オ7．ラスI―マ細胞におぃてはp55TNF 受 容 体 が 優 位 に 発 現 し て お り ，TNFの 作 用 発 現 に はp55TNF受 容 体 が機能的 受容体と して関与 している と考えら れた．
次に，ヒIケ゛リオ7゛ラスIー マ細胞12株 に，256 U/mlまでの低濃度TNFを 3〜 7目 間 作 用 さ せ る と ，MTT試 験 で ほ と ん ど の 細 胞 株 は TNFの 殺 細 胞 効 果 に 対 し て 抵 抗 性 で あ っ た ． し か し 同 様 の 低 濃 度TNFで ， 3H−thymiciine取 り 込 み 試 験 で の DNA合 成 能 を 評 価 す る と ，9細 胞 株で 抑 制 効果 を 認め た ． 以上 よ り，TNFは ケーリオ7 うスIー7細 胞に対し 顕 著 な 殺 細 胞 効 果 を 有 さ な い も の の ， 増 殖 抑 制 効 果 を 示 し 得 る こ とが示唆 された．
TNFの ケ゛リオ7ーうスI− マ細胞に 対する増 殖抑制効果 の機序を 検討する ため に ，BrdU−PI二重 染 色 法に よ る7ロー サ イIメIリ ーで 細 胞周期 解析を 行 な う と ，G o/Gl期 細 胞 の 増 加 とS期 細 胞 の 減 少 を 認 め ， こ のTNF の抗 増 殖 効果 の 一部 は ケ ゛リ オ7゛ラスIーマ細胞のS期におけ るDNA合成が 抑 制 さ れ る こ と に よ り 生 じ る こ と が 示 さ れ た ． さ ら にTNF刺 激 に
‑ 138−
弘 光紀 利 知 部出 川 阿上 皆 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
よ り ，0´ リ オ―マ における分 化度の指標 と考えられ ているglialfibr i llary acidic protein（GFAP）量の変化をフ□―サイIメIリ‐で調べたと ころ，細胞内のGFA蛋白の増加を認め，ク゛リオフ′うスI‐マ細胞でfよTNF により分化が誘導されることが示された．
TNFの 細 胞 障 害 活 性 に お け る 作 用 機 序 は 不 明 な 点 が 多 い が ，7ラ キI゛ン酸代謝における7オス7オリハ．−セーA2の関与が指摘されている．今 回 の 実 験 結 果 か ら も ，TNFに 感 受 性 を 示 し た 細 胞 株 で はTNF処 理 に より培養上清中にPGE2の放出が増加しており，フォス7オリn．−セ゛A2の 賦活化を介する細胞障害効果が少ナょくとも一部のケ．りわ゛ラスI−マ細 胞においてあてはまることが示唆された．
さらに，TNFの殺細胞効果に対するケ゛リオ7゛ラスI−マ細胞の抵抗性の 機 序 を 解 析 す るた め に， 細 胞内Mn−SODを 測 定し た ．Mn−SODは，TN Fに よ る 細 胞 障 害 作 用 か ら 細 胞 を 防 御 す る 防 御 蛋 白 質 と し て 注 目 さ れ て い るf ree radical scavengerの ーっ で ，TNF抵抗 性 の要 因 とする報告もある．ケーリオフーラスIーマ細胞内のMn―SODは様々な値を示 し ，TNF刺 激 に よ り 濃 度 お よ び 時 間 依 存 性 にMn−SODが 誘 導 さ れ る 傾 向 が 見 ら れ た ． し か しTNF感 受 性 株 に お い て 顕 著 に 誘 導 さ れ ， MnーSODがケ゛リオフ゛うスI−マにおいてTNFに対する防御蛋白質として働く 可能性は少ないと考えられた．
直 接的な抗腫 瘍細胞効果 とは別に，TNFにはケ ゛リオーマ由来の細胞 からある種のサイIカイン産生を促すことが報告されている．ケ゛リオ7゛ラ スI−マ細胞のサイIカイン産生能に対するTNFの影響にっいて調べたとこ ろ ， 細 胞 障 害 作 用 を 示 さ な い 比 較 的 低 濃 度 か っ 短 時 間 のTNF作 用 に よ り ，IL−6，IL−8，GM−CSFの 産 生 増 加 を 認め た ．こ の 事実 は TNFの作用を考える上で非常に興味深い．0゛リオフ．ラスF‑マはTNFの細 胞 障 害 活 性 に 対 し て 感 受 性 が 低 い が ， そ れ は 単 に 無 反 応 で あ る というのではなく，ケ゛リオ7゛ラスI−マの代謝のある回路は低濃度・短 時 間 のTNFに 非 常 に 敏 感 に 反 応 す る こ と を 示 し て い る ．TNFが こ れ ら の 生 理 活 性 物 質 の 産 生 を 促 す こ と は ，GFAP産 生 量 の 増 加 と 同様にヶ゛リオフ．ラスI―マ細胞の分化誘導の結果であるのかもしれない 前述したように，ケ．リオ7゛ラスI―マ細胞ではp55TNF受容体が優位で 機 能 的 受 容 体 で あ る 考 え ら れ る ．p75TNF受 容 体 の 機 能 を 推 定 す る た め に ，p55TNF受 容 体 単 独 とp55お よ びp75TNF受 容 体 の 両 者 を 発 現す る 細胞 におい て，TNFの 増殖抑制効 果とサイIカイン産 生能に っ いて比較し たが，明ら かな違いは 見い出せず ，一部のケ゛リオ7ーラ ス1− マ 細 胞 が 発 現 す るp75TNF受 容 体 の 機 能に っ いて は 明 らか に で きなかった．
以上をまとめると，ケ゛リオフ´ラスI−マ細胞はp55TNF受容体という機 能 的 受 容 体 を 持 ち ， 低 濃 度TNFに 対 し て も 種 々 の 反 応 を 起 こ す ． そ の 作用 は 殺細 胞 効 果を も たら す よう に は働 かず ，種々のサ イIカ イ ン やGFAPな ど の 蛋 白 産 生 を 促 す こ と に よ り 細 胞 を 分 化 誘 導 し ， 増 殖 静 止 効 果 を も た ら す の で は な い か と い う こ と で あ る ． 悪 性 神 経 膠 腫 に 対 す るTNFの 臨 床 効 果 は 未 だ 明 瞭 で は な い が ， 本 研 究 に よ り 腫 瘍 細 胞 の 分 化 誘 導 療 法 の ー っ と し てTNFを 利 用 で き る 可 能
一139―
性 が 示 唆 さ れ た ，
ー‑ 140―
