博士（医学） 加藤容崇 学位論文題名
ヒト腫瘍における COX‑2 発現の分子病理学的解析 学位論文内容の要旨
【 背 景 と 目 的 】
腫 瘍 に お け るCOX−2過 剰 発 現 は 多 く の 組 織 で 報 告 さ れ て い る 。 腫 瘍 細 胞 はCOX‑2過 剰 発 現 に よ り 造 腫 瘍 能 の 獲 得 、 細 胞 増 殖 能 の 上 昇 、 抗 ア ポ ト ー シ ス 、 リ ン パ 管 や 毛 細 血 管 な ど 脈 管 新 生 を 促 進 す る こ と が 知 ら れ て い る 。COX‑2阻 害 薬 を 用 い た 検 討 で は 、 長 期 間 の ア ス ピ リ ン 投 与 は 大 腸 癌 発 生 リ ス ク を 減 少 さ せ 、COX‑2阻 害 薬 に よ る 大 腸 癌 に 対 す る 予 防 的 効 果 が 認 め ら れ て い る 。 し か し な が ら 、 大 腸 癌 患 者 に 対 しCOX‑2阻 害 薬 を 用 い た 臨 床 試 験 で は 有 効 性 に 対 し 意 見 が 分 か れ る 結 果 で あ り 、 癌 に 対 し てCQXー2阻 害 薬 に よ る 治 療 の 有 効 性 に 関 し て 一 致 し た 見 解 は 得 ら れ て い な い 。 腫 瘍 細 胞 組 織 中 で のCOX‑2発 現 の 意 義 を 明 確 に す る た め に 、 本 研 究 で は 、 大 腸 癌 お よ び 髄 膜 腫 、 転 移 性 脳 腫 瘍 に 対 し 免 疫 組 織 化 学 的 検 討 を 行 い 、 大 腸 癌 に 対 し て 分 子 生 物 学 的 検 討 を 行 っ た 。
第1章 ヒ ト 腫 瘍 に お け るCOX‑2発 現 の 免 疫 組 織 化 学 的 解 析
【 対 象 と 方 法 】 大 腸 癌 、 髄 膜 腫 お よ び 転 移 性 脳 腫 瘍 に 対 し 抗COX‑2抗 体(Polyclonal antibodyCayman Chemical，Michigan，USA） を 用 い て 免 疫 組 織 化 学 染 色 を 施 行 し 、 腫 瘍 細 胞 のCOX‑2発 現 の 評 価 は 染 色 強 度 と 陽 性 率 を 判 定 し た 。
O大 腸 癌 ： 北 海 道 大 学 病 院 消 化 器 外 科Iに て2002年1月 か ら2004年12月 ま で 施 行 さ れ た 大 腸 癌 切 除 検 体91例 を 用 い た 。 腫 瘍 細 胞 と と も に 周 囲 問 質 細 胞 のCOX‑2発 現 も 評 価 し た 。COX‑2発 現 と 病 理 学 的 進 展 因 子 お よ び 全 生 存 期 間 、 無 増 悪 生 存 期 間 と の 相 関 を 統 計 学 的 に 検 討 し た 。 ま た 、 腫 瘍 細 胞 に 加 え て 浸 潤 部 お よ び 非 浸 潤 部 の 周 囲 問 質 細 胞 の COX‑2発 現 の 相 関 も 同 様 に 検 討 し た 。
◎ 髄 膜 腫 ： 北 海 道 大 学 医 学 研 究 科 腫 瘍 病 理 学 分 野 に て2005年 か ら2012年 の 間 に 髄 膜 腫 と 病 理 診 断 さ れ た76例 を 用 い た 。COX‑2発 現 とWHO Gradeお よ びMIB‑lindexと の 相 関 を 統 計 学 的 に 検 討 し た 。
◎ 転 移 性 脳 腫 瘍 ： 北 海 道 大 学 医 学 研 究 科 腫 瘍 病 理 学 講 座 に て2003年 か ら2012年 の 間 に 髄 膜 腫 と 病 理 診 断 さ れ た166例 を 用 い た 。 ま た166例 の う ち 再 発 し た 症 例13例 に 対 し て も 免 疫 組 織 化 学 染 色 を 施 行 しCOX‑2の 発 現 を 確 認 し た 。
【 結 果 】 ＠ 大 腸 癌 ：74.7％ の 症 例 にCOX‑2発 現 が み ら れ た 。 大 腸 癌 細 胞 お よ び 周 囲 問 質 細 胞 に お け るCOX‑2発 現 と 病 理 学 的 進 展 因 子 と の 相 関 あ る い は 全 生 存 、 無 増 悪 生 存 期 間 と の 間 に 統 計 学 的 有 意 相 関 は 見 ら れ た か っ た が ゅ ＝ 0.550，p:ニ0.124)、 大 腸 癌 細 胞 と 周 囲 問 質 細 胞 と の 間 に は 非 浸 潤 部 で は 統 計 学 的 有 意 相 関 は 見 ら れ な か っ た が ゅ ＝ 0.15)、 浸 潤 部 で は 統 計 学 的 有 意 相 関 を 認 め た ゆ 〓0.0015)。
◎ 髄 膜 腫 ：75.0％ の 症 例 にCOX‑2発 現 が 認 め ら れ た 。 髄 膜 腫 細 胞 のCOX‑2発 現 と 全 生 存 期 間 お よ び 無 増 悪 生 存 期 間 と の 間 に 統 計 学 的 有 意 相 関 は 見 ら れ な か っ た ゆ 〓 0.822，p ＝ 0.970)。WHO Gradeお よ びMIB‑1indexと の 問 に は 統 計 学 的 有 意 相 関 が 見 ら れ た ゅ ＝ 0.0153，p 0.0075)。
◎ 転 移 性 脳 腫 瘍 ：15.0％ の 症 例 にCOX‑2発 現 が 見 ら れ た 。 再 発 し た13例 中1例(7.7％ ）
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にCOX‑2 発現の陽性化を認めた。
第2 章ヒト腫瘍におけるCOX‑2 発現の分子生物学的解析
【対象と方法】大腸癌細胞株(WiDr 、HCA7) およびヒト培養胎児腎細胞く293FT) に対し、
COX‑2
発 現レト ロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを作成し、一過性導 入 およ び ウ イルス感 染を行 った。ま た、COX‑2 の
5′‑UTR 側に
132、120 、90 、
60、
30塩 基対 お よ びKozak 配 列のみ 付加した
COX‑2発 現レトロ ウイル スベクタ ーも作 成し同 様 の検 討 を 行った。
COX‑2発 現確認は ウェス タンブロ ット法 にて確認 し、
COX‑2発現 が 見ら れ た
293FT細 胞 の 培養 液 中 のPGE2 濃度 を
ELISA法に て 測 定し 、得ら れた順 化 培 地 と 大 腸 癌 の 培 地 を 交 換 し
BrdUア ッ セ イ を 行 い 増 殖 能 の 変 化 を 確 認 し た 。
【結果 】いず れの発現ベクターにおいてもウイルス感染によるCOX‑2 過剰発現は認め ら れな か っ た。一過 性導入 において もCOX‑2 の5 ′
‑UTR側に付 加のない 発現ベ クター で は発 現 は 不安定で あり、
5′
‑UTR側に
132塩基 対および
Kozak配 列を付加 した発 現 ベ クタ ー で は安 定 し たCOX‑2 発 現 が見 ら れ、PGE2 濃 度の上 昇が確認 された。 また、
ELISA
によ り
PGE2濃 度の 上 昇 が確 認 さ れた 順化培地 に培養 液を置換 した大腸 癌細胞 株 では 、 元 々培 養 液 中の
PGE2濃 度 が低 い
WiDrのみで
COX‑2発現 誘導が見 られ、
BrdU取 り込 み が 統計 学 的 に有 意 に 上昇 し て いた 。 培 養 液中 の
PGE2濃 度の高 い
HCA7では
COX‑2発 現 誘 導は 見 ら れず 、
BrdU取 り込 み の 統計 学 的 有意 差 は 見 られ な か った 。
【考察】
1
）第
1章の 免疫組織 化学的 検討では大腸癌の浸潤部において大腸癌細胞と周囲問質細胞 の
COX‑2発 現 は統 計 学 的有 意 相 関を 示 し 、髄 膜 腫 では
COX‑2発 現 とWHO Grade お よ び
MIB‑1 indexが 統計学 的に有意 相関を 示すこと を明らか にした 。いずれ もCOX‑2 発現と 予 後に ついては 有意な 相関は認 められな かった が、髄膜 腫にお いて
WHO GradeとMIB‑1
indexに 相関があ ること は髄膜腫 細胞に おいて
COX‑2発現 が悪性化 に寄与す ること が示 唆 され、 大腸癌に おいて 浸潤部に て腫瘍 細胞と周 囲問質細 胞のCOX‑2 発現には相関が見 ら れ た 。 腫瘍 に お ける
COX‑2の主要 なメデ ィエータ ーはPGE2 で あること から腫 瘍細胞 と 周 囲 問 質細 胞 の
COX‑2発 現 との間 にはPGE2 が 介在する 可能性 がある。
PGE2の介在 す る
COX‑2相 互発現の 悪性化 への寄与 を明ら かにする ために 分子生物学的検討を加える必 要があると考えられた。
2
） 第
2章の 分 子 生物 学 的 検討 で は 、COX‑2 の
5′‑UTR 側の 付 加 領域 が
COX‑2安定 発 現 の ために 重要であ ること を示し、 大腸癌 細胞では 培養液中 の
PGE2濃度上昇によりCOX‑2 が誘導され、増殖能が統計学的に有意に上昇することを示した。これは免疫組織化学的検 討 におい て大腸癌 浸潤部 における 腫瘍細 胞と周囲 問質細胞 の
COX‑2発現が相関すること と 合 わ せ 、大 腸 癌 浸潤 部 で は
PGE2を介 するCOX‑2 発現の 正のフ イードバ ック回 路が存 在し、悪性化に寄与することが示された。
【結論】
ヒト腫瘍 における
COX‑2発 現は腫瘍 悪性化 および増 殖能上 昇をもたらす。特に腫瘍浸 潤 部 で は
PGE2を介 す る
COX‑2相 互 誘 導に よ る 正の フ イ ー ドバ ッ ク 回路 が 存 在す る 。
COX‑2阻害 薬により 浸潤部 での正の フイー ドバック 回路を 遮断することにより腫瘍の悪 性 化 を 低 下さ せ る こと で 、
COX‑2は 腫瘍の 治療標的 として 有用であ る可能性 がある 。
【結語】
本 研 究に よ り 腫瘍 に お ける
PGE2を介 するCOX‑2 相互誘 導の正の フイード バック 回路 が 存在し 悪性化に寄与しうることが示されたが、COX‑2 発現と予後との相関あるいは非浸 潤 部での
COX‑2の検 討や、 浸潤部に おいて も腫瘍細 胞や線 維芽細胞、免疫細胞など多く の細胞が存在し、多細胞系での血vitro の検討および面wvo での検討が今後の課題である。
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腫
皮に
ンバ
ウト
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織で
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内に
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明で
病理
質問
と回
ーは
的 検 討 で はCOX−2低 発 現 群 の 予 後 が 最 も 悪 い よ う に 見 え る が 、 ど の よ う に 解 釈 す る か と い う 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、COX―2高 発 現 が 予 後 不 良 因 子 で あ る と い う 報 告 は あ る がcOxー2 低 発 現 が 予 後 不 良 で あ る こ と を 示 し た 報 告 は な く 、 本 検 討 で は 症 例 数 も 少 な い こ と か ら 、 今 後 分 子 生 物 学 的 検 討 を 行 う 必 要 が あ る と 回 答 し た 。 副 査 の 田 中 伸 哉 教 授 か ら はCOX−2染 色 の 病 理 診 断 へ の 応 用 可 能 性 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、 特 に 髄 膜 腫 で は 境 界 悪 性 髄 膜 腫 の 悪 性 度 の 評 価 が 困 難 な 症 例 で はcOx−2染 色 が 有 用 で あ る 可 能 性 が あ る と 回 答 し た 。 主 査 の 神 山 俊 哉 准 教 授 か ら は 、 髄 膜 腫 に お け るcOx―2発 現 と 全 生 存 率 の 有 意 差 が 見 ら れ な い こ と へ の 考 察 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、 検 討 し た 症 例 数 が 少 数 で あ る こ と や 、 死 亡 例 が そ も そ も 少 な く フ オ 口 一 期 間 が 短 い こ と が 統 計 学 的 有 意 差 を 示 さ な い こ と の 理 由 と し て 挙 げ ら れ る と 回 答 し た 。 統 い て 、 腫 瘍 浸 潤 先 進 部 に お け るCOXー2発 現 と 腫 瘍 の Stemnessと の 関 連 性 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 浸 潤 先 進 部 に お け るCOX−2発 現 と Stemnessに つ い て の 報 告 は な い が 、 大 腸 癌 の 浸 潤 先 進 部 で はTumor buddingが 見 ら れ 上 皮 間 葉 移 行 に 関 連 し て い る と い う 報 告 が あ り 、 浸 潤 先 進 部 に 着 目 し てcOx−2発 現 とStemness の 関 連 性 を 検 討 す る こ と は 大 変 意 義 深 く 、 今 後 の 検 討 す べ き 課 題 で あ る と 回 答 し た 。 申 請 者 は い ず れ の 質 問 に 対 し て も 、 検 討 を 行 っ た 際 の 具 体 的 評 価 法 や 既 報 の 論 文 等 を 引 用 し 適 切 に 回 答 し た 。
こ の 論 文 は 癌 に 対 す るCOX−2阻 害 薬 の 有 効 性 を 解 明 し 、COXー2発 現 の 腫 瘍 に 対 す る 悪 性 形 質 へ の 寄 与 を 証 明 す る 上 で 重 要 な 知 見 を 提 示 し て お り 、 腫 瘍 生 物 学 の さ ら な る 発 展 に 寄 与 す る も の と 期 待 さ れ る 。 審 査 員 一 同 は こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 大 学 院 過 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。
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