博 士 （ 医 学 ） 加 藤 総 介
High salt diets dose‑dependently promote gastric chemical carcinogenesis in Helicobacter pylori‑infected Mongolian gerbils associated with a shift in mucin production from glandular to surface mucous cells
（ 食 塩 の Helicobacter pylori 感 染ス ナネ ズミ におけ る胃 発癌 促進 作用 の 用量依存性、およびHelicobacter pylori 感染，胃炎，胃粘液への影響の検討）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
【 背景 と目 的】 食塩 は疫 学的 に胃癌のりスクファクターであり、動物実験で食塩は胃発癌 の promoter であ ると 証明 され ている。しかしその作用機序や、胃発癌の重要な因子である Helicobacter pylori （霞pyl ori) との関連は未だ明らかではない。胃粘液はsurface mucous cell mucin (SMCM) およ ・びgland mucous cell mucin (GMCM) の2 種類のムチンから成って い る。 近年 風pyl ori 感 染への 胃粘 液の 関与 を示 す知 見が 得られており、食塩の作用機序 と して 胃粘 液へ 影響 を及 ばす ことが考えられる。今回、スナネズミ胃発癌モデルを用いて 種 々の 投与 量・ 方式 で食 塩を 摂取 させ 、胃 発癌 ，風 pylori 感染 ，胃 炎お よび 胃粘 液へ の 影響を検討した。
【 材 料 と 方 法 】6週 齢 雄 ス ナ ネ ズ ミ をNーmethyl−N−nitrosourea (MNU)投 与 群 ， 非 投 与 群 に 分 け 、 投 与 群 はMNU 30ppmを 隔 週 で10週 ま で 飲 水 中 投 与 し 、 非 投 与 群 は そ の 問 滅 菌 水 を 投 与 し た 。11週 日 に 両 群 の 一 部 を 丘pylori (ATCC 43504)に 感 染 さ せ 、MNU投 与 （ 以 下MNU（ 十 ） ） /H. pylori感 染 （ 以 下 風pyl ori（ 十 ） ） 群 ，MNU（ 十 ）/H. pylori非 感 染 （ 以 下 霞pylori(‑)） 群 ，MNU非 投与 （以 下 沁町 （一 ））/H. pylori（十 ）群 ，MNU（ っノ 〃．」pロo打（ー）群に分 けた。この 4群 を12週 目 よ り そ れ ぞ れ 通 常 食 （Na濃 度O．32％ ） ，2．5％ 食 塩 食 ，5％ 食 塩 食 ，10％ 食 塩 食 ， 通 常 食 十 飽 和 食 塩 水 （ 濃 度29％ ）4ml/kg週1回 胃 内 投 与 の5条 件 に 分 け 、 計50週 間 飼 育 し た 。 50週 飼 育 後 に 屠 殺 し ， 腺 胃 組 織 標 本 を 作 成 し て 胃 発 癌 率 お よ び 胃 炎 の 評 価 を 行 っ た 。 胃 炎 は 好 中 球 浸 潤 ， 鼡 核 細 胞 浸 潤 ， 腸 上 皮 化 生 ， 異 所 性 腺 管 増 殖 に つ い て そ れ ぞ れ0（none） ， 1（mild） ，2（moderate） ，3（severe） の4段 階 で ス コ ア 化 し た 。 屠 殺 時 に 採 血 し 、 血 清 霞pロ 刪 抗 体 価 ， ガ ス ト リ ン を 測 定 し た 。 ま たMNU（ ― ）/霞pロ 〇 ． ガ （ 十 ）/通 常 食 群 お よ びMNU（ う ／ 彪 pガ 刪 （ 十 ） ／lO％ 食 塩 食 群 で 、homogenizeし た 腺 胃 の 一 部 を 風pロ 刪 選 択 培 地 で37℃ ， 微 好 気 性 条 件 下 に て 5日 問 培 養 し 、 発 育 し た 胤 刪 〇 灯 コ ロ ニ ー 数 を 計 数 し た 。 さ ら に 冊mくl）/彪pロ0打（十）/通常食群，MNU（I冫/風pガ。ぬ（十）/10％食塩食群，MNU（一冫／〃．pロ卯j（−）/
通 常 食 群 お よ ぴMNU（ ー ） ／HガID打 （ − ） ／10％ 食 塩 食 群 で 、homogenizeし た 腺 胃 組 織 の 一 部 よ
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りRNAの 抽 出 と エ タ ノ ー ル 沈 殿 法 に よ る 胃 粘 液 の 分 離 抽 出 を 行 っ た 。RNAか ら そ れ ぞれSMCM， GMCMの コ ア 蛋 白 で あ るMUC5AC，MUC6のrealtime RT―PCRを 施 行 し 、MUC5AC，MUC6のmRNA を 測 定 し た 。 胃 粘 液 はPVDFメ ン ブ レ ン 上 に ブ ロ ッ ト し 、 メ ン ブ レ ン をSMCMを 染 色 す る Galactose−oxidase cold thionine Schiff (GOTS)染 色 ，GMCMを 染 色 す る 抗 ム チ ン 免 疫 染 色 で 染 色 し 、NIH Imageで 比 色 定 量 を 行 っ た 。
【 結果 】MNU（＋ ）/H. pylori（＋ ）群 の 胃発 癌率は、通常食群15%，2．5%食塩食群33%，5％食塩 食 群36%，10%食 塩 食群63%で、 食塩 摂取 量と 有 意に 相関 した （p＜0．01） 。通 常食 ＋飽 和食 塩水 間 欠投 与群 は24%で、 通常 食群 と有 意差 は なか った。MNU（ ＋）／霞pyl ori（―）群で は、5%食塩 食 群 で4%、 そ の 他 の 群 で はO%で 、 食 塩 摂 取 量 と 発 癌 率 に 相 関 はな かっ た 。MNU（ ―） 群で は胃 癌は発生しなかった。
胃炎の評価では、MNU（−）/H. pylori（＋）／食塩食群でMNU（−）/H. pylori（＋）／通常食群より 有意に 好中球浸潤が強かった（p〈0．05）。また異所性腺管増殖がMNU（＋）／風pyl ori（＋）/食塩 食群でMNU（＋）/H. pylori(+)/通常食群より（p〈0．01）、MNU（―）/H. pylori（十）／食塩食群でも MNU（―）/H. pylori（十）/通常食群より（p〈0．05）、いずれも有意に高度であった。抗丘pyl ori 抗 体価 はMNU（I冫/H.、 pylori（＋ ）群 で食 塩摂取量と有 意に相関した(p<0. 0001)。 血清ガスト リンはMNU（ー）／丘pylori（十）/食塩食の各群でMNU（―）／丘pylori（十）/通常食群より有意に高 値であった(p<0. 005)。風pyl ori培養では、MNU（―）/H. pylori（十）/通常食群よりもMNU（ー）/〃．
pyl ori（ ＋ ） /10%食 塩 食 群 で 有 意 に コ ロ ニ ー 発 育 数 が 多 か っ た （ p〈O． 05） 。 胃 粘 液 で は 、 高 食 塩 食 に よ るMUC5AC，MUC6のmRNA発 現 量 の 有 意 な 変 化 は ぬ か っ た が 、 比 色 定 量 で は 高 食 塩 食 に よ りH pylori（ − ） 群 で 有 意 なSMCMの 増 加(p<0. 005)とGMCMの 減 少 （p〈O．05） 、 霞pylori(+)群でSMCMの増 加 傾向 とGMCMの 有意 な減 少（p〈O．05）を 認め た。
【 考 察 】 本 実 験 で 食 塩 は 風pyl ori感 染 ス ナ ネ ズ ミ で の 胃 発 癌 を 用 量 依 存 性 に 促 進 し た 。 H pylori非 感 染 下 で は こ の 作 用 は み ら れ ず 、 則 ち 食 塩 は 胃 発 癌 に お い て 〃 ・pyloriの co−promoterと 考 え ら れ る 。 よ っ て 食 塩 摂 取 量 抑 制 が 霞pylori感 染 ス ナ ネ ズ ミ で の 胃 発 癌 抑 制 に 有 効 で あ り 、 ヒ ト で も 減 塩 に よ り 霞pyl ori感 染 者 の 胃 発 癌 が 減 少 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 一 方 で 飽 和 食 塩 水 少 量 間 欠 投 与 で 胃 発 癌 率 は 上 昇 せ ず 、 曝 露 さ れ る 食 塩 の 濃 度よ り食 塩 の総 摂取 量が 重要 と考 えら れた 。
胃 炎 の 評 価 で は 丘pyl ori（ 十 ） 群 で 食 塩 は好 中球 浸潤 ，異 所性 腺管 増殖 を促 進 し、 血清 抗 霞pyl ori抗体 価はMNU（ −）/H. pylori（ 十） 群に 韜い て食塩摂取量と相関 して上昇した。また 培 養 で は 高 食 塩 食 は 風pyl oriを 有 意 に 増 殖 さ せ た 。 し た が っ て 食 塩 は 且pylori感 染 ， 胃 炎を 増悪 さ せる と考 えら れる 。
食 塩 の 胃 発 癌 促 進 機 序 は 不 明 で あ る が 、 胃 粘 膜 細 胞 を 直 接 傷 害 し 胃 粘 膜 再 生 ・ 増 殖 を 亢 進 さ せ る 、 或 い は 界 面 活 性 作 用 に よ る 表 層 胃 粘 液 バ リ ア ー の 粘 性 低 下 ， 破 壊 に よ っ て carcinogenの 胃 粘 膜 へ の 到 達 を 促 進 す る 等 の 仮 説 が あ る 。 ま た ブ タ 胃 ム チ ン の 経 口 投 与 が 食 塩 の ラ ッ ト 胃 発 癌 促 進 作 用 を 阻 害 す る と の 報 告 も あ り 、 胃 粘 液 ・ ム チ ン は 食 塩 の 胃 発 癌 促 進 と 関 係 す る と 考 え ら れ る 。 ヒ ト や 齧 歯 類 の 胃 で はSMCMとGMCMが 重 層 構 造 を と っ て 表 層 胃 粘 液 バ リ ア ー を 形 成 す る 。 霞pyl oriは 胃 内 でSMGM内 と 表 層 粘 液 細 胞 表 面 に の み 生 存 し て い る こ と 、GMCMが 含 むGlcNAcQ残 基 は 丘pyl oriに 対 し 抗 菌 作 用 を 持 つ 事 が わ か っ て い る が 、 本 実 験 で 食 塩 は ばpyloriの 生 息 可 能 域 で あ るSMGMを 増 加 さ せ 、 同 時 に 風pylori
に抗菌的に働くGMCM を減少させた。則ち食塩は胃粘液環境を〃． pylori 増殖に有利に変化 させる。その結果丘pyl ori 感染が増悪し、胃炎増悪、最終的に胃発癌に至ると考えられ る。 mRNA 発現からはこのムチン量変化はコア蛋白ではなく、糖鎖の変化と考えられる。
【結語】 食塩は胃粘液環境を丘 pyl ori 増殖に有利に変化させ、Apylori 感染下で用量 依存性に胃発癌を促進する。食塩が〃， pylori 感染，胃炎の増悪を通じて胃発癌を促進す る 可 能 性 と 、 減 塩 が ヒ ト 胃 癌 を 減 少 さ せ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
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学位論文審査の要旨
High salt diets dose‑dependently promote gastric chemical ...
carcinogenesis in Helicobacter pylori‑infected Mongolian gerbils associated with ‑a shift in mucin production from glandular to surface mucous cells
（ 食 塩 のHelicobacter pylori感 染 ス ナ ネ ズ ミ に お け る 胃 発 癌 促 進 作 用 の 用 量 依 存 性 、 お よ びHelicobacter pylori感 染 ，胃 炎 ， 胃粘 液 へ の 影響 の 検 討）
食 塩 は 疫 学 的 に 胃 癌 の り ス ク フ ァ ク タ ー で あ り 、 ．動 物 実 験で 食 塩 は 胃発 癌 の promoterで あ る と 証 明 さ れ て い る 。 し か し そ の 作 用 機 序 や 、 胃 発 癌 の 重 要 な 因 子 で あるHelic06日 施rAぬ ． ガ （E盈 カ みヵ と の 関連 は 未 だ明 ら か では ない 。胃粘 液 は 霞 め あ ガ の 生 息 を 可 能 と す る8urfaCemucou8ceumuci11（SMCM） お よ び 霞 め 勸 ゴ に 抗 菌 的 に 働 くglandmucou8CeumuciIlく GMCM） の2種 類 の ム チ ン か ら 成 り 、 近 年 且 餅 あ ガ 感 染 へ の 関 与 を 示 す 知 見 が 得 ら れ て お り 、 食 塩 の 作 用 機 序 と し て 胃 粘 液 ヘ 影 響 を 及 ば す こ と が 考 え ら れ た 。 申 請 者 ら は6週 齢 雄 ス ナ ネ ズ ミにN‐meth・yl‐N．Ilitr080urea（MNU）， ■彫あ ガを投与 するス ナネズミ 胃 発 癌 モ デ ル を 用 い 、 通 常 食 （Na濃 度O．32％ ） ，2．5％ 食塩 食 ，5％食 塩 食 ，10％ 食 塩 食 ， 通 常 食 十 飽 和 食 塩 水 （ 濃 度29％ ）4m1瓜g週1回 胃 内 投 与 の 各 条 件 に 分け て 飼 育 し た 。50週 飼 育 後 に 屠 殺 し 、 胃 発 癌 率 ， 胃 炎 ス コ ア ， 霞 問 盧 滅 培 養 ， 血 清盈彫あガ抗体価，SMCMおよびGMCMのコア蛋白mm乢A定量，SMCM
お よ びGMCMの 比 色 定 量 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、MNU（ 十 冫 ／ 且mあ （ 十 冫 群 の 胃 発 癌 率 は 食 塩 摂 取 量 増 加 と 有 意 に 相 関 し て 上 昇 し た （pくO．Ol） 。MNUく 十 ） ′貝
￠ あd． ） 群 で は 胃 癌は1例 のみ で 食 塩摂 取 量 と発 癌 率 に相 関 は なく 、MNU（ ． ） 群 で は 胃 癌 は 発 生 し な か っ た 。 胃 炎 の 評 価 で は 食 塩 食 は 霞 切 轟 癌 感 染 群 で 好 中 球 浸 潤 お よ ぴ 異 所 性 腺 管 増 殖 を 有 意 に 亢 進 さ せ た 。 抗 霞 彫 あ ガ 抗 体 価 は MNU（‐）′E倒虚な嚢十）群で食塩摂取量と有意に相関して上昇したくpく0．O001）。貝 め協ゴ培養では、MNU（‐）／貝彫あd十冫／通常食群よりもMNU（・）／豆ガあd十）／10％ 食 塩 食 群 で 有 意 に コ ロ ニ ー 発 育 数 が 多 か っ た （pく0．05） 。 ム チ ン コ ア 蛋 白 の mRNA発 現 量 は 食 塩 に よ っ て 変 化 し な か っ た が 、 比 色 定 量 で は10％ 食 塩 食 に よ −416―
哲
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り H. pylori(‑) 群で有意なSMCM の増加（p く0.005) とGMCM の減少くp くO ．05) 、 H. pylori(+) 群でSMCM の増加傾向とGMCM の有意な減少（ p く0.05) を認めた。
以上の結果より、食塩はH. pylori 感染下でのみ用量依存性に胃発癌を促進し、
また胃粘液環境をH. pylori に有利に変化させH. pylori 感染・胃炎を増悪させ た。よって食塩が胃粘液環境変化・且めぬガ感染増悪・胃炎増悪を介して胃発 癌を促進している可能性および減塩がヒト胃発癌抑制に有効である可能性が示 唆された。
口頭発表に際し、副査の秋田教授より本研究でATCC43504 を用いた理由お よび別のH. pylori 菌株での胃発癌，胃癌の分化度と食塩とH. pylori との関係，
研究結果の臨床応用への展望，ヒトでの食塩と胃発癌に関するcohort 8tudy に ついての質問があった。これに対して申請者は、ATCC43504 は胃癌多発国であ る本邦で最も頻度の高い cagA およびvacA 陽性株であること，動物実験では未 検証ではあるが cagA 陰性株では本実験とは異なる結果となる可能性が過去の 報告からは考えられること，食塩と胃癌の分化度の相関は現在まで報告されて いなぃこと，本研究の結果からは霞カあd 除菌が胃癌予防には最も有効であり 除菌不能例でも減塩により発癌率を低下させ得ると考えられること，過去の日 本でのcohort8tudy では食塩と胃発癌との相関が示されていることを回答した。
次いで主査の近藤教授より、実験動物にスナネズミを用いた理由，スナネズミ での霞彫あガ除菌の胃発癌への影響，実験での食塩濃度と実際のヒトの食塩摂 取量とのバランス，本研究での慢性胃炎・胃酸分泌の検討の有無，霞彫あガ感 染期間・飼育期間についての質問があった。これに対して申請者は、スナネズ ミ胃に且緲あd が安定して感染し萎縮性胃炎・腸上皮化生といったヒト胃粘膜 と極めて類似した病変を生じることよルモデル動物として最適と考えられるこ と，霞切ぬ d 除菌によルスナネズミ胃発癌が抑制されること，イクラ醤油漬（食 塩濃度10 ％強）など高食塩濃度の食品が日常的に摂取されており本研究での食 塩濃度設定が妥当であること，胃内のpH は測定していないが食塩により慢性胃 炎増悪・血清ガストリン上昇がみとめられ低酸状態であったと考えられること，
本実験での感染期間・飼育期間はスナネズミの平均寿命（およそ 3 年）を考慮 するとヒトの数十年間に相当し十分な期間と考えられることを回答した。更に 副査の浅香教授より、発癌剤と豆ガぬ d の投与順序を変えたデザインでの食塩 の影響の検討の有無，日本国内での胃発癌率の地域差の原因について質問があ った。これに対して申請者は、且霞皿2 オ→発癌剤の順で投与した食塩の発癌実 験は未施行であること，霞めあガ菌株の地域分布および食塩摂取量の差が胃発 癌率の地域差の原因と考えられることを回答した。
本研究は胃発癌に対する食塩と霞甜あd の役割と作用機序を明らかにし、減 塩が胃発癌を抑制することを示した。本研究を基に、盈彫あガ除菌，減塩とい った具体的な胃発癌予防や、新しい胃癌の化学予防法の開発が期待される。
審査員一同はこれらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽・取得単 位なども併せて申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有する ものと判定した。
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