博 士 （ 医 学 ） 加 地 苗 人
学 位 論 文 題 名
膵 癌 血 行 性 転 移 の 分 子 機 構 ： ー 膵 癌 ・ 血 管 内 皮 相 互 作 用 に お け る 膵 癌 由 来 サ イ ト カ イ ン の 重 要 性 一
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
【はじめに】
膵 癌患 者の 予後 を不 良 にす る一 要因 とし て遠 隔臓 器へ の血 行性 転移 があ げら れる。近 年接 着分 子の 関与 が、 多 段階よりぬる癌の血行性転移においても重要と考えられ ている。
これまでに我々は、膵癌細胞株において細胞表面上に1 ）sialyl Lewis a(SLe゜）およびsialyl Lewisx(SLe ）を 発現 し ている株（陽性株）と両方共に発現していない株（陰性 株）が存 在 し 、2） 陽 性 株 は 外 来 性 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン(IL―1ロ、TNF‑a）で 活性 化さ れた 血管 内 皮 細 胞 に 対 し 接 着 増 強 を 示 す こ と 、3） こ の と き の 接 着 増 強 は 抗SLeaお よ び 抗E‐ selectin抗体により阻害されるため、膵 癌細胞上のSLe＾が活性化内 皮細胞との接着に重要 であ るこ とを 報告 して き た。 この こと は、 既存 の炎 症局 所へ の膵 癌細 胞の 血行 性転移の ヌカ ニズ ムを 示唆 する 実 験事 実と 考え られ る。 一方 実際 の症 例で は、 必ず しも 炎症局所 にの み転 移を 起こ して い ると は限 らな いと 思わ れる 。こ のた め今 回の 実験 では 、膵癌細 胞自 体か らの 血管 内皮 細 胞活 性化 物質 産生 能お よび その 物質 によ り媒 介さ れる 膵癌・内 皮細胞接着増強の機構にっき検討した。
【材料 と方法】
1）膵癌細胞株は、我 々が樹立したヒ卜膵癌培養株6株PCI−6，10，19，24，35，43を用いた。
細胞表面上のSLe゜/SLe はPCI‑10，24，43の3株にのみ陽性であり、PCIー6，19，35は陰性であ る。血管内皮細胞(HUVEC)はヒト臍帯静脈より単離し得た。
2） 膵 癌 細 胞 に よ る 内 皮 細 胞 上 表 面 分 子 の 発 現 調 節 を み る た め 、 膵 癌 細 胞 培 養 上 清液 (PCI‑S/N)ま た はHUVECの1/10量 の 膵 癌 細 胞 （ 以 下 少 量PCI)をHUVECと 反 応 さ せ 、 HUVEC上 のE−selectin，ICAM‑1の発現 を螢光免疫染色、間接フ口ーサイトヌトリー法にて 検 討 し た 。 ま たHUVECをPCI‑S/Nま た は 少 量PCIに て 処 理 後 のPCIと の 接 着 を5iCrア ッ セイ 法に て検 討し 、さ らに 内皮 細胞 上に 抗ICAM‑1， 抗E‑selectin抗体 、膵 癌細 胞上 に抗 SLea，SLe 抗 体 を そ れ ぞ れ 添 加 し 各 抗 体 が 接 着 に 及 ぼ す 効 果 に っ き 検 討 し た 。 3） 膵癌 由来 可 溶性 因子 の検 索の ためPCI−S/Nの熱 処理 ・酸 処理を行い内皮細胞活性化作 用を検討した。次に内皮細胞上にE‑selectin，ICAM‑1を誘導する既知のサイ卜カインである IL‑1Q， ロ 、TNF‑QのELISAに よ りPCI‑S/N中 の サ イ ト カイ ンを 測定 し た。 また これ らサ イトカインの特異抗体によるPCI‑S/Nの中和効果も併せて検討した。
4） 上 記 内 皮 細 胞 活 性 化 因 子のPCI表面 上 の膜 結合 型の 有無 を、 固定 後PCIの内 皮細 胞上
E‑selectin誘導能を指標として検討した。
【結果】
1） 膵 癌 細 胞 と の 相 互 作 用 に よ る 内 皮 細 胞 上 の 接 着 分 子 の 発 現 調 節 螢 光免 疫染 色、 フロ ーサ イト メ トリ 一法 いず れに よっ ても 、PCI‑S/N、少量PCI処理に てHUVEC上 のE‑selectin，ICAM‑1の発 現増強を認め た。この発現誘導作用は強度に多少の 差は ある もの のSLea/SLex陽 性・ 陰性 を問わず樹立 された6株すべてのPCIに認められた。
2） 膵 癌細 胞と 内皮 細胞 の接 着
PCI‑S/Nま た は 少 量PCIを 事 前 に 処 理 し たHUVECで はPCIと の 接 着 の 増 強 が 認 め ら れ た。 この 接着 増強 はPCI側に 抗SLe＾抗 体を、HUVEC側に抗E‑selectin抗体を作用させるこ とに より 著明 に抑 制さ れた 。
3） 膵 癌由 来内 皮細 胞活 性化 （可 溶性 ）因 子の 検討
PCI‑S/Nによ るHUVECに対するE‑selectin誘導能 は70℃以上の熱処理にて失活した。ま た酸 処理 後の 誘導 能は 非処 理群 と 同程 度に 認め られ た。
内皮 細胞 活性 化作 用を 有す るサ イ 卜カ インのうちIL‑1ロ，TNFーaに関してはELISAによっ てPCIーS/N中 に検 出で きず 、各 々 の特 異抗 体に よっ ても 発現 誘導 活性は吸収できなかっ た。 一方ELISAによ りIL‑1Qは6株 すべ てのS/Nに おい て1000‑2000pg(10‑20u)/mlの範囲で 検出 され た。 また 、抗IL‑1ぱ抗 体 によ りPCI−S/NのHUVEC上のE‑selectin発現誘導活性は 著 明 に 抑 制 さ れ 、 こ の 抗 体 処 理 に よ り 、PCI‑S/Nに よ るPCIとHUVECの 接着 増強 はほ ぽ 完全 に抑 制さ れた 。
4）E‑selectin発現 誘導 物質 の膜 結合 型の 有無
PCIを固 定後HUVECと接 触さ せる こと によ って も、HUVEC上にE‑selectinは 誘導 され 、 この 誘導 効果 は抗IL‑1a特異 抗体 処理 によ り消 失し た。
【考察】
近年 、腫 瘍自 ら の産 生す るサ イト カイ ンが 報告 され てお り、 この サイトカインが腫 瘍 細 胞のautocrineな増 殖を 誘導 した り、 腫瘍 細胞自身および周辺細胞の表面分子の発現 を 調 節す る可 能性 が 示唆 され てい る。 今回 我々 の樹 立し た膵 癌株 にお いても腫瘍由来の サ イ 卜カ イン 様血 管 内皮 活性 化因 子の 存在 が明らかになった 。この因子はSLe゜/SLe 陽 性 株．．陰I生株いずれも産生しており 、これにより血管内皮細胞表面上のE一selectinの発現 が 増 強 し 、 陽 性 株 とHUVECと の 接 着 も 増 強し た。ELISA、特 異抗 体に よる 活性 吸収 効果 に よ り 、 こ の腫 瘍由 来物 質 の主 要な 有効 成分 とし てIL‑1aの 存在 が示 され た。 この こと か ら非 炎症 部位 に おい ても 膵癌 細胞 自体 の産 生す るサ イト カイ ンを 通して血行性転移 を 起 こす 可能 性が 示 唆さ れた 。ま たこ の腫 瘍由 来物 質が 機能 的な 膜結 合型として存在す る ことは、血液の流動状態の環境内での膵癌細胞と血管内皮細胞のdirect contact，rollingによ り近傍の内皮細胞を次々と活性化する可能性を示唆している。
癌血 行性 転移 の プ口 セス は多 段階 より なっ てお り、 今回 の実 験は 総合的な転移能の 一 局 面に つい ての も ので ある 。し かし 臨床 上においてSLe°がその抗原決定基であるCA19‑9 が 血行 性転 移の 有 効な マー カー とな って おり 、CA19‑9高値 例が 明ら かに予後が不良で あ る とい う報 告は 、 臨床 上で もSLe＾ が重 要な 生物活性分子であることを物語っている事 実
と考えられる。
【結語】
1．樹 立 し た膵 癌 株6株 す べ てに お い て、 膵 癌 細 胞自 体 の産 生する血 管内皮 活性化サ イ ト カイ ン の 存在 が 明 らか に さ れた 。
2．こ の 因 子の 主 体 はIL‑1aで あ るこ と が 判 明し 、 こ れに より内 皮細胞 が活性化 され既 存 の炎症を 欠く部 位におい てもSLea依 存性の接 着増強 が起こる 可能性が 示唆さ れた。ま た こ の と き 、 膵 癌 表 面 膜 結 合 型 のIL‑1aの 作 用 も 重 要 で あ る可 能 性 が考 え ら れた 。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
膵癌血行性転移の分子機構：ー膵癌・血管内皮相互作用 における膵癌由来サイ卜カインの重要性―
膵癌は消化器癌の うち最も予後不良の癌のーつであり、その予後を不良とするー要因として遠 隔臓器への血行性転 移があげられる。また近年接着分子の関与が、多段階よりなる癌の血行性転 移におぃても重要と 考えられている。本研究では膵癌血行性転移の基礎的検討として、膵癌細胞 と内皮細胞の接着お よび接着を媒介する膵癌細胞自体からの血管内皮活性化物質産生能にっき検 討した。
膵癌細胞は我々が樹立したヒ卜膵癌培養株6株PCI−6，10，19，24，35，43を用いた。細胞表面上の のSLe゜/Sle はPCI‑10，24，43の3株のみに陽性でありPCト6，19，35は陰性である。血管内皮細胞 (t[UVEC)はヒト臍帯静脈より単離し得た。Sしe＾陽性膵癌株と内皮細胞の接着は、外来性サイトカ イン(ILー1P. TNF‑a）で内皮細胞上にE−select,inを発現誘導することにより増強を示す。ー方少 量の膵癌細胞（内皮細胞の約1/10量）を事前に内皮細胞と反応させておくことによっても、SLe．陽 性株と内皮細胞の接 着は増強を示した。この膵癌細胞を事前にパラホルムアルデヒドで固定した 後内皮細胞と反応さ せても、E―selectin誘導能を認めた。また、われわれの樹立した膵癌細胞6 株の培養上清液いずれもが、内皮細胞上のE−selectin，ICAM―1誘導能を有していた。SL.e´陽性株 と内皮細胞の接着は、陽性株側のSLe 、内皮細胞側のE‐selectinをそれぞれ単ク口ン抗体にてブ 口ッ・クすることにより著明に抑制された。一方抗SLe 抗体、抗ICAM−1抗体処理によっては抑制 は認めなかった。このことより膵癌株は培養上清中に血管内皮細胞にEーselectinを発現させる可 溶性因子を自ら産生 しており、この因子は膵癌細胞表面上に機能的な膜結合型としても存在する ことが示された。この因子は70℃で失活し、 ELISA，nothern blot analysis、特異抗体による吸 収によりIL‐1P、TNFaとは異なる物質であるこ とが明らかになった。一方膵癌株6株すべてに ELISAにてIL‐laの蛋白が検出され、nothern解析におぃてIL―1ば特異的mRNAの存在も確認された。
さらにIL−1ゼの特異抗体により培養上清による内皮細胞上のEーselectin誘導能はほぼ完全に抑制 された。
以上のことより膵 癌細胞自身の産生するサイ卜カイン（IL―la）による血管内皮活性化現象が 確かめられ、既存の炎症以外の部位におぃてもSLe 陽性膵癌が、血管内皮と接着して転移結節を 作る可能性が示唆された。
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口頭発表におぃて細川教授より、 SLe‐/SLe 陽性株・陰性株間で実際の臨床上で他臓器転移に 差がみられたか、ユn vivoでの転移の確認の有無、膵細胞がサイ卜カイン産生能を獲得する時期 はぃっか、自己産生サイ卜カインで発現増強される他の接着分子の可能性を、武市教授より他臓 器転移の接着の次のstepで ある浸潤能についてはどうか、TNF‑a産生の可能性がなぃかを、皆川 教授より接着分子の転移促進・抑制への意義について、牧田教授より膵癌細胞側のSLe．とSL,e の 発現のcorrelationにっいて、SLe /SLe 発現を増強もしくは減弱させる条件について、阿部和 厚教授よりE−selectinは膵癌細胞と接着していないfreeな内皮細胞上にも認められるか、金田教 授より他臓器転移の際の転移先の臓器特異性について詳細な質問があったが、申請者はおおむね 妥当な回答をした。また、細川、武市両教授には個別に審査をいただき、合格と判定された。膵 癌血行性転移の基礎的検討として新たに膵癌自己産生のサイ卜カインを関連させた本研究の意義 は大きく、学位授与に値するものと考える。
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