博士（医学） 猪又崇志 学位論文題名

     博士（医学）   猪又崇志 学位論文題名

喫煙誘導肺気腫の病態におけるカタラーゼの役割に関する研究

学位論文内容の要旨

【 背 景 と 目 的 】 慢 性 閉 塞 性 肺 疾 患(Chronic obstructive pulmonary disease， 以 下COPD)は， 主 に 慢 性 喫 煙 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る 肺 で の 慢 性 炎 症 反 応 と 関 連 す る ， 持 続 性 の 気 流 閉 塞 を 特 徴 と す る 疾 患 で あ る ．COPDは 全 世 界 で の 主 要 な 死 因 の ー っ で あ り ， ま た 世 界 的 に も 有 病 率 や 死 亡 率 が 現 時 点 の み な ら ず ， 将 来 的 に も 上 昇 し 続 け る と 予 測 さ れ て い る 疾 患 で あ る ， 日 本 で は ， 疾 病 に よ る 死 因 と し て は 男 性 で 第5位 ， 全 体 で も 第7位 で あ り ， 年 間 約1万6 千 人 がCOPDに よ っ て 死 亡 し て お り ， さ ら に 年 余 に わ た り 増 加 傾 向 で あ り 日 本 社 会 の 負 担 と な る 事 が 予 想 さ れ て い る ． 日 本 で のCOPDの 有 病 率 は40歳 以 上 で は8.6％ と さ れ て お り ， 患 者 数 は 約530万 人 と 推 計 さ れ て い る ．

  COPD患 者 肺 の 病 理 学 的 な 特 徴 と し て ， 末 梢 気 道 病 変 と 肺 胞 破 壊 で あ る 肺 気 腫 が 種 々 の 程 度 に 混 在 し て い る こ と が 知 ら れ て い る ， し か し ， そ の 病 態 に 関 し て は 完 全 に は 解 明 さ れ て い な い ． こ れ ま で の 報 告 で は ， 好 中 球 や マ ク ロ フ ァ ー ジ よ り 放 出 さ れ る 好 中 球 エ ラ ス タ ー ゼ や マ ト リ ッ ク ス メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ に 加 え ， 喫 煙 に よ っ て 産 生 さ れ る 過 剰 な オ キ シ ダ ン ト と 生 体 に 存 在 す る ア ン チ オ キ シ ダ ン ト と の 不 均 衡 に よ っ て 生 じ る 酸 化 ス ト レ ス が ， 肺 気 腫 形 成 に 重 要 な 役 割 を 演 じ て い る と さ れ る ．

  カ タ ラ ー ゼ は240kDの4量 体 蛋 白 で あ り ， 生 体 内 で の 主 要 な オ キ シ ダ ン ト で あ る 過 酸 化 水 素(H202)を 水 へ と 分 解 す る 抗 酸 化 酵 素 の ー っ で あ る ． カ タ ラ ー ゼ は 肺 に お い て は 気 道 上 皮 細 胞 や 肺 胞 上 皮 細 胞 ， 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど に 存 在 し ， 細 胞 内 で は ペ ル オ キ シ ソ ー ム に 分 布 し て い る が ， 好 中 球 の 細 胞 質 内 に も 存 在 す る ． カ タ ラ ー ゼ とCOPD′ 肺 気 腫 の 関 連 に 関 す る 知 見 は 乏 し く ， そ の 病 態 に お け る 役 割 に 関 し て は 不 明 で あ る ．

  そ こ で ， 喫 煙 誘 導 肺 気 腫 の 病 態 に お け る 抗 酸 化 酵 素 カ タ ラ ー ゼ の 役 割 を 明 ら か に す る 事 を 目 的 と し て 本 研 究 を 企 画 し た ．

【 対 象 と 方 法 】 動 物 実 験 と し て カ タ ラ ー ゼ 活 性 の な いC3H/AnL CSbCSb(ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス ） とC3H/AnL Cs℃s° （ 野 生 型 マ ウ ス ） ， 並 び にC57BL/6Jマ ウ ス を 使 用 し た ． そ の 取 り 扱 い と す べ て の 実 験 手 技 及 び プ ロ ト コ ー ル は ， 北 海 道 大 学 動 物 実 験 に 関 す る 規 定 及 び 北 海 道 大 学 動 物 実 験 実 施 マ ニ ュ ア ル に 基 づ き ， 北 海 道 大 学 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認 を 経 て 施 行 し た ． ま た 臨 床 研 究 に お い て は ， 北 海 道 大 学 病 院 へ 通 院 中 のCOPD患 者 を 対 象 群 と し て ，COPD の な い 喫 煙 者 ，COPDの な い 非 喫 煙 者 を 対 照 群 と し て 登 録 し ， ヘ ル シ ン キ 宣 言 ， 臨 床 研 究 に 関 す る 倫 理 指 針 に 基 づ き ， 文 書 と し て 記 載 さ れ た 説 明 同 意 書 を 用 い て 説 明 し ， 本 人 の 自 由 意 思 に 基 づ き 参 加 さ れ た ．

  マ ウ ス ヘ の 喫 煙 曝 露 はSIS‑CS systemを 用 い て 喫 煙 チ ャ ン バ ー 内 で 主 流 煙 を 鼻 よ り 吸 入 さ せ た ， 10日 間 の 喫 煙 曝 露 を 短 期 喫 煙 曝 露 ，16週 間 を 長 期 喫 煙 曝 露 と 定 義 し た ． 肺 の 形 態 学 的 評 価 は パ ラ フ イ ン 包 埋 肺 固 定 標 本 を へ マ ト キ シ リ ン ・ エ オ ジ ン 染 色 し 光 学 顕 微 鏡 で 観

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察 し て 行 っ た ．RNA抽 出 は 凍 結 肺 標 本 よ りRNase Mini Kitを 使 用 し て 行 い ，TaqMan Gene Expression Assays probeを 用 い てRT‑PCRを 施 行 し た ， 好 中 球 走 化 性 はBoyden chamberを 用 い て 評 価 し た ． 凍 結 肺 組 織 ， パ ラ フ ア ン 包 埋 肺 固 定 標 本 は ， 酸 化 ス ト レ ス や ア ポ ト ー シ ス を 評 価 す る た め ， そ れ ぞ れ 免 疫 組 織 化 学 的 検 討 の 為 に 使 用 し た ． 同 肺 組 織 の 抽 出 液 は カ タ ラ ー ゼ 活 性 ， グ ル タ チ オ ン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 の 測 定 に 使 用 し た ． マ ウ ス 骨 髄 由 来 好 中 球 はPercoll液 を ， ヒ ト 好 中 球 はFicoll Paque液 を 用 い て そ れ ぞ れ 分 離 し ， 好 中 球 か らのH202 放 出 ，ROS放 出 ， カ タ ラ ー ゼ 活 性 ， カ タ ラ ー ゼ 発 現 に 関 し て 評 価 し た ． 抗 酸 化 酵 素 と し て PEG‑カ タ ラ ー ゼ ，N‑ア セ チ ル シ ス テ イ ン を 用 い た ． 好 中 球 膜 か ら のalア ン チ ト リ プ シ ン 放 出 と そ の 酸 化 に 関 し て は ， ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ っ て 評 価 し た ，

【 結 果 】16週 間 長 期 喫 煙 曝 露 モ デ ル に お い て ， ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス 肺 で は 野 生 型 マ ウ ス 肺 と 比 較 し て 有 意 に 肺 気 腫 が 増 悪 し て い た ． 同 モ デ ル に お い て は ， ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス 肺 に お い て ， 野 生 型 マ ウ ス 肺 と 比 較 し て ， 優 位 に 酸 化 ス ト レ ス が 亢 進 し ， 肺 胞 上 皮 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス も 増 加 し て い た ． 10日 間 短 期 喫 煙 曝 露 モ デ ル に お い て は ， ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス 肺 か ら の 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中 の 総 炎 症 細 胞 数 ， 中 で も 好 中 球 数 が 野 生 型 マ ウ ス 肺 と 比 較 し て 有 意 に 増 加 し て い た ． 同 モ デ ル で は 酸 化 ス ト レ ス に 関 し て 両 群 で 有 意 差 を 検 出 す る 事 は 出 来 な か っ た が ， 抗 酸 化 酵 素 に 関 し て は 野 生 型 マ ウ ス 肺 で グ ル タ チ オ ン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 が 喫 煙 曝 露 後 に 上 昇 し た の に 対 し て ， ア カ タ ラ セ ミ ア マ ウ ス 肺 で は こ の 代 償 的 上 昇 が 認 め ら れ な か っ た ． 両 群 に お け る 肺 で の 喫 煙 誘 導 好 中 球 炎 症 の 違 い は ， 好 中 球 ケ モ カ イ ン の 違 い で は な く ， 好 中 球 走 化 性 の 違 い に よ っ て 生 じ て い た ， ま た カ タ ラ ー ゼ 活 性 の 低 下 し た マ ウ ス 骨 髄 由 来 好 中 球 は 走 化 性 が 亢 進 し て お り ， こ の 亢 進 効 果 はPEG‑カ タ ラ ー ゼ ， N‑ア セ チ ル シ ス テ イ ン 投 与 に よ り 相 殺 さ れ た ． ま た カ タ ラ ー ゼ 活 性 の 低 下 し た 好 中 球 か ら のH202やROS放 出 は 有 意 に 亢 進 し ， そ れ に よ っ て 好 中 球 膜 か ら 放 出 さ れ るalア ン チ ト リ プ シ ン の 酸 化 が 有 意 に 増 加 し て い た ． カ タ ラ ー ゼ 経 静 脈 投 与 は10日 間 短 期 喫 煙 曝 露 に よ っ て 生 じ る 肺 好 中 球 炎 症 を 有 意 に 低 下 さ せ た ． ヒ トCOPD患 者 好 中 球 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 は COPDの な い 喫 煙 者 並 び にCOPDの な い 非 喫 煙 者 よ り 採 取 し た 好 中 球 と 比 較 し て 有 意 に 低 下 し ，H202放 出 は 有 意 に 増 加 し て い た ． こ の 効 果 はCOPD病 期 判 定 の 指 標 で あ る 対 予 測1 秒 量 と 相 関 し て い た ，

【 考 察 】 本 研 究 に よ り ， カ タ ラ ー ゼ 活 性 の 欠 損 は 反 復 喫 煙 曝 露 に よ っ て 生 じ る 肺 好 中 球 炎 症 を 増 悪 さ せ ， そ れ に 引 き 続 き 生 じ る 肺 気 腫 形 成 を 促 進 す る こ と が 明 ら か と な っ た ， ま た こ の 喫 煙 誘 導 肺 好 中 球 炎 症 は 好 中 球 カ タ ラ ー ゼ 活 性 が 低 下 す る 事 に よ っ て 生 じ る ， 好 中 球 走 化 性 に よ っ て 生 じ て い た ． こ れ は 我 々 が 知 り 得 る 限 り 最 初 の 報 告 で あ る が ， 抗 酸 化 酵 素 で あ る カ タ ラ ー ゼ 活 性 の 好 中 球 で の 低 下 が ， 直 接 的 に 好 中 球 走 化 性 の 亢 進 を 介 し て 好 中 球 炎 症 に 寄 与 し て い る 点 で 意 義 深 い 発 見 と 考 え る ， ま た そ の 機 序 と し て 好 中 球 膜 のalア ン チ ト リ プ シ ン の 酸 化 が 関 与 し て お り ， 酸 化 ス ト レ ス が 好 中 球 走 化 性 に 関 与 し て い る 傍 証 と な る と 考 え る ． 更 にCOPD患 者 好 中 球 に お い て は ，COPDの な ぃ 喫 煙 者 やCOPDの な い 非 喫 煙 者 と 比 較 し て カ タ ラ ー ゼ 活 性 が 有 意 に 低 下 し ，H202放 出 が 亢 進 し て お り ， マ ウ ス で の 検 討 を ヒ ト に 当 て は め る 事 が 出 来 る な ら ば ， 好 中 球 カ タ ラ ー ゼ 活 性 の 低 下 し て い る 個 体 は COPD発 症 感 受 性 が 高 い と 推 察 さ れ る ． さ ら に マ ウ ス ヘ の カ タ ラ ー ゼ 投 与 実 験 に お い て 喫 煙 誘 導 肺 好 中 球 炎 症 を 有 意 に 抑 制 し た 点 か ら は ， 酸 化 ス ト レ ス に よ る 好 中 球 集 積 が 病 態 に 関 係 し て い る 疾 患 に お け る カ タ ラ ー ゼ の 治 療 潜 在 性 に つ い て も 期 待 し う る と 考 え る ．

【 結 論 】 好 中 球 カ タ ラ ー ゼ 活 性 の 低 下 は ， 好 中 球 走 化 性 の 亢 進 と そ れ に 伴 う 肺 好 中 球 炎 症 の 増 悪 に よ っ て 喫 煙 誘 導 肺 気 腫 を 増 悪 さ せ る ，

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学位論文審査の要旨 主査 副査

副査 副査

教 授 教 授 教 授 准 教 授

秋 田 弘 俊 西 村 正 治 三 輪 聡 一 濱 田 淳 一

学 位 論 文 題 名

喫煙誘導肺気腫の病態におけるカタラーゼの役割に関する研究

最 初に 秋田 教授 より 猪 又崇 志君につい て紹介があった後，喫煙誘 導肺気腫の病態におけるカタ ラ ー ゼの 役割 に関 する 研 究に ついて，約

分間にわたって発表があ った．内容は研究の背景とな る 慢 性閉塞性 肺疾患(COPD)/ 肺気腫の病態 及び抗酸化酵素力夕ラーゼ について紹介があった後，力 夕 ラ ーゼ 活性 の欠 損し た アカ タラセミア マウスを用いた短期，長期 の喫煙曝露実験によって，カ タ ラ ーゼ 活性 の低 下は 肺 での 上皮細胞ア ポトーシス増加や酸化スト レス亢進を生じ，肺好中球炎 症を 増強させること，更には肺 気腫をより増悪させることを示した．また好中球を用いたin vitro ，

の実 験によって，好中球における カタラーゼ活性の低下は， 好中球からの活性酸素種や過 酸 化 水素

産生 を増 加 させ ，好中球走 化性を亢進させることを明 らかとした．最後にヒトCOPD 患 者 を 対 象 と し た 観 察 研 究 に お い て ，ヒ トCOPD 患者 の好 中球 で は，

を発 症し て いな い喫 煙 者 及び 健常 非喫 煙者 と 比較 して，力夕 ラーゼ活性が低下しH202 産 生が亢進していることを明ら か に した ．最 後に マウ ス 及び ヒトにおけ るデータを総括し，力夕ラ ーゼ活性の低下は肺において ア ポ 卜ー シス の増 加， 酸 化ス トレスの増 強に加え，好中球走化性の 亢進によって生じる肺好中球 炎 症 の 増 悪 な ど を 介 し て ， 喫 煙 誘 導 肺 気 腫 の 病 態 を 増 悪 さ せ る こ と が 示 さ れ た ，

質 疑応 答で は， 最初 に 濱田 准教授より ，アカタラセミアマウスで のカタラーゼ活性低下に関す る 機 序に 関し て質 問が あ り， 力夕 ラー ゼ遺 伝 子発 現は 正常 で ある が，

の翻 訳や蛋白代謝の 段 階 にお ける 遺伝 子変 異 があ るためにカ タラーゼ活性が低下すると 返答があった．またカタラー ゼ 活 性の 低下 した 高原 病 患者 において， 喫煙者では肺気腫を発症じ やすいとのデータがあるかど う か に関 して 質問 があ り ，現 時点では高 原病患者における肺気腫感 受性に関するデータは報告さ れ て いな いが ，今 回の 研 究結 果を踏まえ ると，高原病患者は健常正 常人と比較して，慢性喫煙に より 肺気腫を発症しやすいこと が予想されると返答があった ，

次 に三 輪教 授か ら， ヒ トCOPD 患 者に おい て カタ ラー ゼ活 性 が低 下し てい る機 序に関して質問

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が あ り ， 今 回 の 結 果 か ら はmRNA発 現 に 関 し て は 各 群 で 有 意 差 は な い の で ， 力 夕 ラ ー ゼ 遺 伝 子 の 翻 訳 や 蛋 白 の 代 謝 な ど に 関 し て 異 常 が 起 こ っ て い る 可 能 性 が あ り ， エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク な 因 子 の 関 与 も 想 定 さ れ る ， し か し ， 現 段 階 で は 何 故COPD患 者 に お い て 好 中 球 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 が 低 下 し て い る か に 関 し て は 不 明 で あ る と 返 答 が あ っ た ． ま た 喫 煙 に よ っ て 生 じ るH202に 関 し て ， 基 本 的 に は 直 接 産 生 さ れ る 系 は 主 要 で は な く ，NADPHオ キ シ ダ ー ゼ を 介 し て 産 生 さ れ る ス ー パ ー オ キ シ ド がSODに よ っ て 代 謝 さ れ る 経 路 が 主 要 で あ る と コ メ ン ト が あ っ た ． 更 にPEG・ 力 夕 ラ ー ゼ 投 与 実 験 に お い て ， そ も そ も 好 中 球 内 にPEG・catalaseが 入 っ て い る の か ど う か ， ど こ に 作 用 し て い る の か に つ い て 質 問 が あ り ，PEG．catalaseは 分 子 量 が 大 き く 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る 事 は ， 何 ら か の 能 動 輸 送 系 が な け れ ば な く ， 作 用 点 と し て は 細 胞 外 のH202が 想 定 さ れ る ． 他 の デ ー タ は 細 胞 内 の カ タ ラ ー ゼ 活 性 が 低 下 し た 場 合 に ， 好 中 球 の 走 化 性 が 亢 進 す る こ と を 証 明 し て お り ， 今 回 のPEG．catala8eの デ ー タ は カ タ ラ ー ゼ の 作 用 点 と い う 意 味 で は 異 な る ， デ ー タ の 意 味 付 け が 異 な る た め ， 力 夕 ラ ー ゼ が 関 与 す る 別 の 実 験 と 考 え て い る 旨 返 答 が あ っ た ．   秋 田 教 授 か ら は ， ヒ トCOPD患 者 対 象 の 結 果 に 関 し て ， 力 夕 ラ ー ゼ 遺 伝 子 多 型 の 関 与 に つ い て 質 問 が あ り ， 本 研 究 の 対 象 群 を 用 い た 別 の 遺 伝 子 多 型 に 関 す る 検 討 を 第 一 内 科 で 行 っ た が ， 力 夕 ラ ー ゼ 活 性 に 遺 伝 子 多 型 が 関 わ っ て い る こ と は 確 認 出 来 な か っ た と 返 答 が あ っ た ． し か し ， 力 夕 ラ ー ゼ 発 現 に 関 わ る 遺 伝 子 多 型 の 違 い に よ っ て ， 力 夕 ラ ー ゼ 活 性 の 個 体 差 が 生 じ ， 結 果 と し て タ バ コ 感 受 性 に 高 低 の 差 が 生 じ る 可 能 性 は 考 慮 さ れ る と 返 答 が あ っ た ．   最 後 に 西 村 教 授 よ り ， 本 研 究 は 結 果 の 関 連 性 や 内 容 に 不 十 分 な 点 も 散 見 さ れ る が ，COPD′ 肺 気 腫 の 病 態 に お け る カ タ ラ ー ゼ の 役 割 に 関 し て 明 ら か に し た 最 初 の 研 究 で あ り ， 今 後 の 発 展 も 期 待 さ れ る 旨 総 括 が あ っ た ．

  こ の 論 文 は 現 在 、Journa10fClimca11nvestigation誌 に お い て 要 修 正 と 判 断 さ れ て お り ， 追 加 実 験 を 行 っ た う え で の 掲 載 も 期 待 さ れ ， 今 後 の 治 療 薬 と し て の カ タ ラ ー ゼ 利 用 に 関 し て 発 展 も 期 待 さ れ る ，

  審 査 員 一 同 は ， こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し ， 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ ， 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 授 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た ．

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