博士（医学） 吉田 繁 学位論文題名
皮膚創傷治癒におけるNKG2D システムの機能に関する研究 学位論文内容の要旨
【 背 景 と目 的 】
マ ウ ス 皮 膚 に はden曲ticepidennalTcells（DETCs） と 呼 ば れ る 価T細 胞 が 多 数 常 在 し ， 皮 膚 に お け る 免 疫 監 視 と 創 傷 治 癒 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る ．NKG2DはNK細 胞 の 活 性 化 レ セ プ タ ー の ー つ で あ る が ， そ れ はDETCsに も 発 現 し て お り ，DETCs活 性 化 の 副 刺 激 シ グ ナ ル と 考 え ら れ て い る ．NKG2Dリ ガ ン ド は 感 染 ， 腫 瘍 化 ， 組 織 損 傷 ，DNA損 傷 の よ う な 細 胞 ス 卜 レ ス で 発 現 が 誘 導 さ れ る ． マ ウ スNKG2Dリ ガ ン ド に はRAE‐ln‐ ￡fretinoic acidearlyinducibleln‐ ￡ ） ，H60a‐c（histocompa6bility60a・c），MULTL1（mouseUL16−binding protein‐liketranscnpt1） が 知 ら れ て お り ， そ の う ちH60cは 当 分 野 で 同 定 さ れ たNKG2D リ ガ ン ド で あ る ．H60cは そ の 遺 伝 子 発 現 が 主 に 皮 膚 に 限 局 さ れ る こ と か ら 皮 膚 免 疫 に お け る 機 能 が 示 唆 さ れ て お り ， 実 際 ， 創 傷 皮 膚 で の 〃 ．6DcmRNA増 加 が 報 告 さ れ た が 、 NKG2Dシ グ ナ ル に よ るDETCsの 活 性 化 が 創 傷 治 癒 に 関 与 す る と い う 直 接 的 な 証 拠 は 得 ら れ て な い ． 従 っ て ， 本 研 究 で は 皮 膚 創 傷 部 で 発 現 す るH60c夕 ン バ ク 質 がDETCs活 性 化 と 創 傷 治 癒 に 関 与 し て い る か 否 か を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た ．
【 材 料 と 方 法 】
リ コ ン ビ ナ ン 卜H60cも し く はH60c‐Fc融 合 夕 ン バ ク 質 を ラ ッ ト に 免 疫 し ，H60cに 特 異 的 な モ ノ ク 口 ナ ル 抗 体 を 作 製 し た ． 創 傷 皮 膚 で のH60c夕 ン パ ク 質 発 現 は 免 疫 染 色 に よ り 確 認 し た ．WoundclosureaSsayは マ ウ ス 背 部 に 直 径2mmの 創 傷 作 製 後 ，10嵋 の 抗 体 を 投 与 し ，7日 間 創 傷 部 面 積 を 測 定 し た ． 創 傷 皮 膚 周 辺 のDETCsの 形 態 観 察 は 創 傷 耳 よ り 剥 離 し たepidernlalsheetのFITC標 識 抗 マ ウ スV一TCR抗 体 に よ る 免 疫 染 色 に て 確 認 し た ， 〃 6伽 遺 伝 子 の 発 現 はrealltimeR1、 ．PCRに て 相 対 定 量 値 を 算 出 す る こ と に よ り 測 定 し た ． 創 傷 部 か ら MACSピ ー ズ に よ りDETCsを 回 収 し ， KGF‐ 1遺 伝 子 の 発 現 を conventionalKr‐PCRに よ り 検 出 し た ．PCRに よ ル シ ス テ イ ン を セ リ ン に 変 異 さ せ たH60c 発 現 プ ラ ス ミ ド を 作 製 し ， 変 異H60c夕 ン バ ク 質 を 得 た ， 変 異 H60c夕 ン パ ク 質 と NKG2Dと の 結 合 ア フ イ ニ テ ィ ー の 測 定 に はsu雨 ceplasmonreSonance法 を 用 い た ，
【 結 果 】
H60cに 特 異 的 な 2つ の 抗 体 lF10と 5G6を 得 た ． 5G6は H60cと NKG2Dと の 結 合 を 阻 害 す る 阻 害 抗 体 で あ っ た ， 創 傷12時 間 後 の 創 傷 部 辺 縁 上 皮 でH60c夕 ン パ ク 質 の 発 現 が 確 認 さ れ た ， し か し な が ら ， 他 のNKG2Dリ ガ ン ド で あ るRAE‐ 1とMULluの 発 現 は 確 認 さ れ な か っ た ． 背 部 の 創 傷 部 位 に 阻 害 抗 体5G6を 投 与 し た 群 で は コ ン ト 口 一 ル 抗 体 投 与 群 と 比 較 し て ， 約1日 創 傷 治 癒 が 遅 延 し て お り ， 基 本 的 に 価T細 胞 欠 損 マ ウ ス で 観 察 さ れ る と 同 様 の 治 癒 動 態 を 認 め た ． 他 方 ，H60cとNKG2Dと の 結 合 を 阻 害 し な い lF10投 与 群 で は ， 創 傷 治 癒 の 遅 延 は 認 め ら れ な か っ た ， ま た ， 抗NKG2D抗 体 投 与 群 で も 創 傷 治 癒 の 遅 延 が 確 認 さ れ た ．5G6投 与 マ ウ ス で は ， 創 傷3，6時 間 後 に 創 傷 部 辺 縁 で 樹 状 形 態 を 失 っ たDETCs数 の 滅 少 とKGF‐1mRNA産 生 の 抑 制 が 確 認 さ れ た ．150番 シ ス テ イ ン を セ リ ン に 変 異 さ せ た モ ノ マ ー 型 のH60c夕 ン パ ク 質 とNKG2Dと の 結 合 ア フ イ ニ テ ィ ー は 鰯 二 二26土3．2nMで あ り ， 他 の 高 ア フ イ ニ テ イ ーNKG2Dリ ガ ン ド と ほ ぼ 同
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等 の 値 で あ っ た ．H60c遺 伝 子 は 皮 膚 以 外 の い く っ か の 上 皮 組 織 に お い て も 転 写 さ れ て お り ， こ れ ら の 組 織 で はH60cに 比 ベ ， 他 のNKG2Dリ ガ ン ド の 発 現 が 低 い こ と が 確 認 さ れ た ，
【 考 察 】
DETCsは 上 皮 恒 常 性 の 維 持 や 組 織 の 損 傷 ， 感 染 ， 炎 症 ， 腫 瘍 化 に 対 す る 免 疫 監 視 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る ．NKG2Dリ ガ ン ド は ス 卜 レ ス 誘 導 性 の 自 己 分 子 で ，DETCs活 性 化 の 副 刺 激 シ グ ナ ル と 考 え ら れ て い る ．H60cは 皮 膚 で 発 現 す る 主 要 なNKG2Dリ ガ ン ド で あ り ・ 最 近 の 研 究 でH60c mRNAが 創 傷 皮 膚 で 発 現 増 加 し ，in vitroでH60cを 発 現 す る ケ ラ チ ノ サ イ ト がDETCsに よ り 傷 害 さ れ る こ と が 示 さ れ た ． し か し な が ら ，H60cとNKG2D と の 相 互 作 用 が 創 傷 治 癒 に 関 わ る こ と を 支 持 す る 直 接 的 な 証 拠 は こ れ ま で 存 在 し な か っ た ． 本 研 究 で 創 傷 辺 縁 の ケ ラ チ ノ サ イ ト でH60c夕 ン バ ク 質 が 発 現 し ，H60cとNKG2D間 の 相 互 作 用 の 遮 断 がDETCsの 活 性 化 を 阻 害 し ， 創 傷 治 癒 を 遅 延 さ せ る こ と が 示 さ れ た ． 最 近 ，DETCsの 活 性 化 に 関 与 す る 副 刺 激 分 子 と し てcoxsackie and adenovirus receptor (CAR) が 同 定 さ れ た ．CARは 損 傷 し た 皮 膚 ケ ラ チ ノ サ イ ト で 発 現 が 誘 導 さ れ ，DETCsに 発 現 す るJAML (junctional adhesion molecule‑like protein)と 結 合 す る こ と で ，DETCsを 活 性 化 す る ． H60cと CARは と も に 損 傷 ケ ラ チ ノ サ イ 卜 に 発 現 し ， H60c‑NKG2Dも し く は CAR‑JAML間 の 相 互 作 用 を 遮 断 す る こ と で 創 傷 治 癒 が 障 害 さ れ る こ と か ら ， 創 傷 が 効 率 的 に 治 癒 す る に は ， こ れ ら 両 方 の り ガ ン ド と レ セ プ タ ー の 相 互 作 用 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ る ． 先 行 研 究 で は ，H60cとNKG2Dと の ア フ イ ニ テ ィ ー は ， 他 のNKG2Dリ ガ ン ド に 比 べ て10倍 以 上 も 弱 い と 報 告 さ れ て し ゝ た ． そ れ に も 関 わ ら ず ，H60c発 現 細 胞 は 高 ア フ イ ニ テ ィ ーNKG2Dリ ガ ン ド 発 現 細 胞 と 同 等 の 効 率 でNK細 胞 に 溶 解 さ れ る ， 本 研 究 に お い て ， 哺 乳 類 細 胞 で は モ ノ マ ー 型 のH60c夕 ン パ ク 質 が 発 現 す る の に 対 し ， 先 行 研 究 で ア フ イ ニ テ ィ ー 測 定 に 使 用 さ れ た パ ク テ リ ア 由 来H60c夕 ン パ ク 質 は ダ イ マ ー で あ る こ と が 確 認 さ れ た ． 生 体 内 で のH60cは モ ノ マ ー と 考 え ら れ ， モ ノ マ ー 型 のH60cは 他 の 高 ア フ イ ニ テ ィ ーNKG2Dリ ガ ン ド に 匹 敵 す る ア フ イ ニ テ ィ ー でNKG2Dと 結 合 す る ． こ の こ と は ，H60cが 創 傷 治 癒 の 動 態 に 強 い 影 響 を 及 ぼ す と し 〕 う 今 回 の 知 見 と 一 致 す る ． 興 味 深 し ゝ こ と に ，H6Dcは 皮 膚 以 外 の い く つ か の 臓 器 ， 特 に 眼 ， 舌 ， 食 道 ， 雌 生 殖 器 で も 転 写 さ れ て い る ， 舌 や 雌 生 殖 器 の 上 皮 に はVY4V61TCRを 有 す る 価T細 胞 が 常 在 す る こ と か ら ， そ こ でDETCsと 同 様 の 機 能 を 果 た し て い る こ と が 想 像 さ れ る ． 眼 の 角 膜 縁 に は 多 く の 価 T細 胞 が 存 在 し ， 価T細 胞 欠 損 マ ウ ス で は 角 膜 上 皮 の 治 癒 が 損 な わ れ る ， こ れ ら の 知 見 か らH60cは 皮 膚 の み な ら ず 他 の 上 皮 組 織 に お い て も ， そ こ に 常 在 す る 価T細 胞 の 活 性 化 を 制 御 し て い る 可 能 性 が あ り ，H60cが 広 く 上 皮 一 般 の 恒 常 性 維 持 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る ．
【 結 論 】
1．H60cは 損 傷 し た 皮 膚 ケ ラ チ ノ サ イ 卜 で 発 現 す る 主 要 なNKG2Dリ ガ ン ド で あ り ， DETCsを 活 性 化 さ せ ，KGF‐1の 産 生 を 促 進 す る こ と で 創 傷 治 癒 に 関 与 す る こ と が 明 ら か に な っ た ．
2． 生 体 内 で 発 現 す るH60cは モ ノ マ ー で あ り ， モ ノ マ ー 型 のH60cとNKG2Dと の ア フ イ ニ テ ィ ー は 他 の 高 親 和 性NKG2Dリ ガ ン ド と ほ ぽ 同 等 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た ．
3． 〃6伽 遺 伝 子 は 皮 膚 以 外 の い く つ か の 上 皮 組 織 で も 恒 常 的 に 転 写 さ れ て い る こ と が 示 さ れ た ．
4．H60cは 皮 膚 の み な ら ず ， 広 く 上 皮 の 恒 常 性 維 持 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．
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学位論文審査の要旨 主査 副査
副査 副査
教授 教授 教授 教授
西村 笠原 清水 瀬谷
学 位 論 文 題 名
孝司 正典 宏 司
皮膚創傷治癒におけるNKG2D システムの機能に関する研究
本 研 究に お いて， 申請者は マウス のNKG2D リ ガンド であるH60c が 創傷治 癒に重要 な役割 を 担って いること を明らか にした ，申請者 の樹立 した抗H60c モノク口ーナル抗体1F10 と5G6 は・
フローサイトメトリー，螢光免疫染色及びウェスタンブロット解析において，優れた特異性を示 し た ， ま た， 5G6 は H60c と NKG2D と の結 合 を 阻害 し ， NK 細 胞 の細 胞 傷 害 活性 を 抑 制し う る 抗体であることが示された，申請者は樹立した抗体を用い，創傷皮膚の螢光免疫染色をおこない，
創傷 部 の 表皮 ケラ チノサイ トにH60c の 発現が誘 導され ることを 示した ．他の NKG2D リガ ンド である RAE‑1 ，MUI 」T ￣ 1 の発現は観察されなかったことから，H60c が創傷部位のケラチノサイ 卜で 発 現 する 主要 なNKG2D リ ガンド であるこ とが示 された， さらに， H60c リガン ドの創 傷治 癒にお ける役割 を調べる ために woundclosureassay を おこな い，阻害 抗体5G6 を局所投与した マウ ス で は創 傷 治 癒 が遅 延 す るこ と も 明ら か に した ， 5G6 投 与 マウ スで は表皮に 常在す る NKG2D 陽 性 Y6T 細胞 であるdendriticepidermalTcells （ DETCs ）の活 性化が阻 害され ，再上皮 化に重要なサイ卜カインである keratinocytegrowthfactor ・ 1 （ KGF ．1 ）mRNA の転写が抑制され ていた ．また， 様々な組 織での H60c 遺伝子 の転写量 をりアルタイムPCR にて測定し，皮膚以外 にも食 道，眼， 舌，膣な ど Y6T 細胞が豊 富に常 在する組織で転写を認め，その転写量はマウス NKG2D リガンドのなかで最も高いことを明らかにした．
こ れ らの 知 見を踏 まえて， 申請者 はH60c が創傷 部位の ケラチノ サイ卜 で発現し ， NKG2D を 介して DETCs を活 性化し ，KGF ． 1 を産 生させ ることで創傷治癒に関与していると結論した．さ らにH60c が 皮膚以外 の上皮 組織でも 転写さ れている ことから ，それ らの組織 でもH60c が皮膚 と同様の機能を有している可能性を示唆するとともに，H60c が体表面での免疫監視や恒常性維持 に重要な役割を担っていると考察した．また，今回の研究成果が Y6T 細胞を標的とした慢性創傷 の治療へと応用される可能性について言及した．
発 表終了後 ，副査の瀬谷教授から，正常組織においてもH60c 遺伝子の転写がある理由を問わ
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れ ， 正 常 皮 膚 で は 転 写 は さ れ て い る も の の タ ン パ ク 質 と し て は 発 現 し て し な い こ と ， 他 のNKG2D リ ガ ン ド で も 同 様 の こ と が 報 告 さ れ て お り ， 刺 激 に 対 し て 迅 速 に り ガ ン ド タ ン パ ク 質 を 発 現 さ せ る た め にmRNAが す で に 細 胞 内 に 用 意 さ れ て い る と 考 え ら れ て い る と 回 答 し た ， 副 査 の 清 水 教 授 か ら は 今 回 の 創 傷 治 癒 の 評 価 方 法 で は 真 皮 の 治 癒 ま で 評 価 さ れ る の で は な い か と 問 わ れ ， 発 表 者 は 確 か に 真 皮 の 治 癒 も 評 価 に 入 っ て く る が ， 今 回 注 目 し て い る の はKGF‑1に よ る 表 皮 の 治 癒 の 評 価 で あ る こ と を 説 明 し た と こ ろ ， 清 水 教 授 よ り 表 皮 の 治 癒 評 価 に は エ ピ ポ リ ー と い う 方 法 が 有 効 で あ る と の 助 言 が あ っ た ， ま た ， 螢 光 免 疫 染 色 で 表 皮 の 最 外 層 に 強 い 蛍 光 を 認 め る が そ れ は ど う 解 釈 す る か を 問 わ れ ， 申 請 者 は 角 質 層 の 非 特 異 的 な 螢 光 で あ る と 返 答 し た ， 主 査 の 西 村 教 授 か ら は 創 傷 皮 膚 に 存 在 す るY8T細 胞 の タ イ プ に 経 時 的 な 変 化 を 認 め た か を 問 わ れ ， 発 表 者 は 創 傷12 も し く は24時 間 後 で はVy3 TCRを 有 す る 単 一 のy8T細 胞 を 確 認 し た が ，48時 間 後 に は 多 く の タ イ プ のy8T細 胞 を 確 認 し た と 返 答 し た ． 西 村 教 授 か ら 炎 症 部 に は 常 在 性 のY8T細 胞 以 外 に も 異 な る タ イ プ のy8T細 胞 が 浸 潤 す る こ と か ら ，H60cが 浸 潤Y8T細 胞 と も 相 互 作 用 し ， 何 ら か の 機 能 を 果 た し て い る 可 能 性 が あ る の で 今 後 更 に 詳 細 な 研 究 が 必 要 で あ る と の 助 言 が あ っ た ， 最 後 に ， 副 査 の 笠 原 教 授 か ら はH60cが 皮 膚 創 傷 治 癒 だ け で は な く 体 表 面 に お け る 恒 常 性 維 持 や 免 疫 監 視 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と を 示 し た 有 意 義 な 研 究 で あ る と の 意 見 が あ っ た ， こ の 論 文 は ，H60c‑NKG2D相 互 作 用 が 皮 膚 創 傷 治 癒 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る と い う ， 新 た な NKG2Dシ ス テ ム の 機 能 を 明 確 に し ， さ ら にH60cが 皮 膚 だ け で は な く 体 表 に お け るdanger signalと し て 機 能 し ， 免 疫 監 視 や 恒 常 性 の 維 持 に 関 与 し て い る こ と を 示 唆 し た 点 が 高 く 評 価 さ れ た ． 審 査 員 一 同 は ， こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し ， 大 学 院 博 士 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 も 併 せ ， 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た ．
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