博士（医学） 吉田孝行 学位論文題名

     博士（医学）   吉田孝行 学位論文題名

  Effects of AhR ligands on the production of   immunoglobulinsinpurified mouseBcells

（精製マウスB 細胞における抗体産生へのAhR リガンドの影響）

学位論文内容の要旨

【 背 景 と 目 的 】

Aryl hydrocarbon receptor

（

AhR

） は 環 境 汚 染 物 質 で あ る

2

，

3

，7，8‑tetrachlolodibenzo‑p‑dioxin(TCDD)に代表されるダイオキシン等の多環性芳香 族炭化水素化合物によって活性化される核内受容体である。その主な作用としては薬物代謝 酵 素(CYPIA1、1A2等）の発現誘導の転写因子として働くことが知られている。また、

TCDD

による種々の毒性（催奇形性、免疫抑制、発ガンの促進等）は

AhR

により仲介され ることが報告されている。

  

近 年、

AhR

リガンドが

T

細胞のTh17/Treg分化や

Thl/2

分化に影響を与えることが報告 さ れるな ど、

AhR

の

T

細 胞分化 への関与を示す報告が相次いでおり、

AhR

の免疫系での 機能が注目されている。一方、

AhR

の

B

細胞における機能については、現在までのところ 良 くわかっていない。これまでに、TCDD投与マウスにおける抗体産生抑制、TCDDによ る マウス

B

細胞 株からの

IgM

産 生抑制等 の報告 がなされ ており、

B

細胞においてもAhR が抗体産生に何らかの機能を有していることが推察されていた。しかしながら、TCDDは 毒性が強く、且つ、

AhR

以外への作用も示唆されていることから、

B

細胞でのAhRの機能 を解析するツールとしては

TCDD

以外の

AhR

アゴニストによる検証が望ましいと考えられ る。現在までのところ、幾っかの内在性AhRアゴニストの存在が報告されているが、これ までに内在性AhRアゴニストによるB細胞の抗体産生への影響については報告がされてい なかった。

  

本研究は

B

細胞における

AhR

の機能を解析する目的で、卜リプ卜ファ冫代謝産物で内在 性AhRアゴニストのーつである2‑(1 H‑indole‑3 'carbonyl)‑thiazole‑4‑carboxylic acid

methylester (ITE)

と 、対照化 合物と して合成

AhR

アン タゴニストである

CH223191

の

2

種類の化合物を用い、精製マウス

B

細胞からの抗体産生への影響を評価し、その作用機 序を解析することを目的として実験を行った。

【材料と方法】  マウス脾臓よルナイーブB細胞を磁気ビーズにより精製し、

ITE

又は

CH223191

添加後にT細胞依存的な刺激であるanti‑CD40抗体と

IL‑4

で共刺激を行った。

培養

3

口 目 及び

6

日 目に 、培養細 胞より

total RNA

を 精製し、

Quantitative RT‑PCR (qRT‑PCR)

法により各種遺伝子の発現量を測定した。また、培養6日目の培養上清につ いて、

IgM

、IgGl及 び

IgE

量を

ELISA

法によ り測定した。また、培養

6

日目の培養細胞 を 用 い 、

ELISPOT

法 に て 一 定 細 胞 数 あ た り の

IgGl

産 生 細 胞 数 を 測 定 し た 。

【結果】  精製したマウス

B

細胞を各

AhR

リガンド存在下でanti‑CD40抗体/IL‑4で共刺 激 を行い、 培養6日目の

AhR

及び

AhR

活 性化マ一 力―遺 伝子であ るCyplal遺伝 子発現 への影響を

qRT‑PCR

法にて評価した。その結果、各リガンドによる

AhR

発現への影響は 認められなかった。一方、

Cyplal

発現は

AhR

アゴニス卜である

ITE

処理により顕著に誘 導され、AhRアンタゴニストであるCH223191処理では影響は認められなかった。以上の 結果より、

ITE

は培養6日目までAhR活性化能を保持していることを確認した。次に、上 記 条件下で の精製 マウス

B

細胞か らの

IgM

、

IgGl

及び

IgE

産生への影響を

ELISA

法にて 評 価した。 その結 果、ITE処理によ り精製 マウス

B

細胞からの

IgM

、IgGl及び

IgE

産生 量は

50

％程度まで抑制された。一方、

CH223191

処理ではIgGl産生量が若干ながら促進

    ‑1

一

する傾向を示した。

  AhR

ルガ ンドに よる抗体 産生制 御の作用 機序を解 明する 目的で、 培養

3

日目の各AhRル ガンドに よるク ラススイ ッチヘの 影響を 評価した 。その 結果、ITE及び

CH223191

処理は

B

細胞のクラススイッチに重要なァ1及び￡ gerImnal transcriptsの発現や組み換え関連酵 素で あ る

AID

や

UNG

の 発現 に は 影響 を 与 え なか っ た 。次 に 、

AhRlj

ガ ン ドによ る

B

細 胞 のプラズ マ細胞 分化への影響を評価する目的で、培養6日目の細胞を用いて各抗体の膜結 合 型 及 び 分 泌 型

mRNA

の 発 現 を

qRT‑PCR

法 で 評 価 し た。 そ の 結 果、

ITE

処 理 は

IgGl

及 び

IgE

の 膜 結 合 型mRNAの 発 現 にほ と ん ど影 響 を 与え な い が、 分 泌 型

mRNA

の発 現 を 抑 制し て い た。 ま た、ELISPOT解析に より、

AhR

リガ ンドによ る

IgGl

抗体 分泌細 胞形成へ の影響を 評価し た。その 結果、ITE処理 はIgGl分泌 細胞形成 を抑制し 、CH223191処理は 促進することを確認した。

  

さらに、

ITE

に よるプラ ズマ細 胞分化抑 制のメカニズムを解析する目的で、培養6日目 のプラズマ細胞分化促進転写因子(Blimp・1、XBP‑1)、プラズマ細胞マーカー(Syndecan‑l)、 プラ ズ マ 細胞 分 化抑制転 写因子

(Pax‑5)

の 発現への 影響をqRT‑PCR法に て評価 した。そ の結果、

ITE

処 理により

XBP‑1

及 び

Syndecan‑l

の発現は抑制される傾向を示した。一方、

Blimp‑l

、Pax‑5の発現にはほとんど影響を示さなかった。

  

以上の結 果は、 内在性ア ゴニス トである

ITE

がマウスB細胞に直接作用して、プラズマ 細胞 へ の 分化 を 抑 制す る こ とに よ り 、抗 体 産 生 を抑 制 し てい る こ とを 示してい る。

【 考 察 】

  

本 研究 に お いて 、

TCDD

同 様、 内 在 性AhRア ゴニ ス 卜 であ る

ITE

も 、

B

細 胞 に 直接作用し、抗体産生を抑制することが明らかとなった。この結果は、内在性

AhR

リガ ン ドが生体内においてB細胞の分化・機能を制御している可能性を示唆している。一方、

合 成

AhR

ア ン タゴ ニ ス トで ある

CH223191

は弱い ながら も

IgGl

産生を 促進す る活性を 示 し た。この 結果も、

B

細 胞におい て内在性AhRリガンドが抗体産生に影響を与えているこ とを示唆するものかもしれない。

  

本 研究の結 果、ITEによる

B

細胞 の抗体 産生抑制 機序は 、

B

細胞のプラズマ細胞への分 化の抑制であることが明らかとなった。

B

細胞のプラズマ細胞への分化は、いくっかの転写 因子から成るネットワークにより制御されていることが報告されている。この内、Blimp‑l と

XBP‑1

はプ ラズマ 細胞分化 促進転写因子として報告されており、一方、Pax‑5はプラズ マ 細胞分化 抑制転写 因子と して報告されている。これまでに

LPS

刺激したマウスB細胞株 の 研 究 で、

TCDD

は

Pax‑5

の発 現を誘 導するこ とにより 、Pax‑5がBlimp．

1

、

XBP‑1

の発 現を抑制し、プラズマ細胞分化を抑制するヌカニズムが提唱されている。一方、本研究の結 果 では、

ITE

は

Pax‑5

、Blimp．

1

発 現には ほとんど 影響を 与えておらず、

XBP‑1

発現を抑 制 していた。

XBP‑1

はプラズマ細胞分化に必須な転写因子であり、主に分泌関連の遺伝子 発現制御に働いていると報告されている。ITEは主にXBP‑1の発現を抑制することにより、

プラズマ細胞への分化を抑制しているのかも知れない。

【結 論 】

  

本 研 究 によ っ て、内 在性AhRアゴニ ストであ るITEがマウス

B

細 胞に直接 作 用して 、その抗体産生を抑制することが明らかとなった。今後、AhRアゴニストによる抗 体産生抑制作用の詳細な分子メカニズムを解明することにより、B細胞をターゲットとした 抗 自 己 免 疫 疾 患 薬 、 抗 炎 症 薬 等 の 開 発 が 期 待 で き る か も し れ な い 。

ー2−

学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

  EffCtsofAhRligandsontheproductionof   immunoglobulinSinpuri6edmouSeBCellS

（精製マウスB 細胞における抗体産生へのAhR リガンドの影響）

  

本研究 において 、AhRの内在性 アゴニ ストであ るITEと合成AhRアンタゴニス卜である

CH223191

を用い、精製マウスB細胞からの抗体産生への影響、及び、その作用機序につい て検討 した。申 請者は 、本実験 系におい て、ITE処理によりB細胞からのIgM、

IgGl

及び

IgE

の産生が抑制されることを確認した。また、CH223191処理により抗体産生量がわずか に増加傾向になることを観察した。ITEによる抗体産生抑制の作用メカニズム解析では、

ITE

処理はクラススイッチや各抗体の膜結合型mRNAの発現には影響を与えないが、分泌型

mRNA

の発現 を抑制す ること を確認し た。さ らにITE処理によりIgGl抗体産生細胞数が減 少し、プラズマ細胞のマーカー遺伝子であるSyndecan−1の発現も抑制されることを確認し た。また、プラズマ細胞分化に関与する3つの転写因子(Blimp―1、XBP―1、Pax―

5

）につい て、ITE処理による発現への影響を評価した結果、プラズマ細胞の誘導因子である

XBP

―

1

の発現 が抑制さ れてい ることを確認した。以上の結果は、AhRアゴニストがB細胞に直接 作用し、XBP―

1

の発現を抑制することによルプラズマ細胞への分化を抑制している可能性 を示唆するものであった。

  

学位論 文発表後 、副査 である清野研一郎教授からAhRアゴニストは

in vivo

でも抗体産 生に作 用するの か質問 があり、未発表データであるが、AhRアゴニストによるマウス

IgE

産生モデルでのIgE産生抑制効果を確認しているとの返答があった。また、副査である高 岡晃教教授からITEと

CH223191

はどの様な化合物かとの質問があり、ITEは豚の肺よりAhR アゴニスト活性のある内在性アゴニストとして精製された化合物であり、CH223191はAhR のレポ ータージ ーンア ッセイでTCDDに対しアンタゴニス卜活性を有する化合物としてス クリーニングされてきた化合物であるとの返答があった。さらに、AhRリガンドの抗体産 生抑制作用の種差の影響について質問があり、未発表データであるが、AhRアゴニストに よるヒ トB細 胞からの 抗体産生抑制効果を確認しているとの返答があった。また、ITEに よる抗体の分泌型mRNAの発現抑制はXBP−1の発現抑制により説明が可能かとの質問があり、

分泌型

mRNA

の合成に はCstF−64の発現が関与していると報告されているが、これまでに

XBP

―1がCstFー64の発現を制御しているとの報告はなく、また、

ITE

がCstF−

64

の発現に 影響を与えているかは今回検討していなぃとの返答があった。また、副査の西村孝司教授 より、免疫系が関与する各種疾患に対し、AhRのアゴニストやアンタゴニストを薬剤とし

‑3ー

光 郎

司 教

   

   

一

利 研

孝 晃

出

野

村

岡

上

清

西

高

授

授

授

授

教

教

教

教

査

査

査

査

主

副

副

副

て 使 用 す る 場 合 、 ど の よ う な こ と を 考 慮 す べ き か と の 質 問 が あ り 、AhRは 今 回 示 し たB細 胞 の 他 に も 、T細 胞 へ の 作 用 が 報 告 さ れ て い る こ と か ら 、 対 象 と す る 疾 患 に お い てB細 胞 やT細 胞 が ど の 様 に 関 与 し て い る か を 明 ら か に し て 、 さ ら に こ れ ら の 細 胞 に 対 す る 各AhR リ ガ ン ド の 作 用 を 把 握 す る こ と に よ り 、 総 合 的 に 判 断 す る 必 要 が あ る と の 返 答 が あ っ た 。 ま た 、 主 査 の 上 出 利 光 教 授 よ りITEのB細 胞 とT細 胞 へ の 作 用 用 量 に 違 い は あ る か と の 質 問 が あ り 、ITEのT細 胞 へ の 影 響 は 未 検 討 で あ る が 、 今 後 、 是 非 検 討 す る 予 定 で あ る こ と 、 ま た 、 マ ウ スB細 胞 へ の 作 用 用 量 は マ ウ スAhRに 対 す るKd値 と ほ ば 同 じ 用 量 か ら 作 用 し て い る と の 返 答 が あ っ た 。 さ ら に 、 進 化 の 段 階 でAhRは ど の 段 階 か ら 存 在 し て い る の か 、 及 び 、AhRは 外 来 異 物 に 対 す る 制 御 分 子 と し て 働 い て い る が 、 進 化 の 過 程 で のAhRの 存 在 意 義 は 何 か と の 質 問 が あ り 、 下 等 な も の で はC． elegansやDrosophilaの 段 階 で 既 にAhR遺 伝 子 の 存 在 が 報 告 さ れ て い る こ と 、 及 び 、 こ れ ら 無 脊 椎 動 物 で はAhRにligand binding domain が 無 い 事 か ら 、AhRは 本 来 生 体 形 成 に 必 要 な 分 子 と し て も と も と 存 在 し て い た と 考 え る が 、 脊 椎 動 物 へ 進 化 す る 過 程 で 外 来 異 物 に 対 す る 制 御 分 子 と し て の 機 能 を 獲 得 し た と 考 え て い る と の 返 答 が あ っ た 。

  こ の 論 文 は 、AhRア ゴ ニ ス ト が 直 接B細 胞 に 作 用 し てIgM、IgGl及 びIgE産 生 を 抑 制 す る こ と 、 及 び 、AhRア ゴ ニ ス ト の 抗 体 産 生 抑 制 に お け るXBP―1の 重 要 性 を 示 し た の み で な く 、 内 在 性 のAHRア ゴ ニ ス ト が 実 際 にB細 胞 で 作 用 す る こ と を 示 し た 点 で 高 く 評 価 さ れ 、 今 後 、 炎 症 や 自 己 免 疫 疾 患 の 改 善 を 目 指 し た 新 規 治 療 法 の 開 発 に 寄 与 す る こ と が 期 待 さ れ る 。

  審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 こ れ ま で の 研 究 活 動 に お け る 研 鑽 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

―4