博 士 （ 医 学 ） 篠 原 信 雄
学 位 論 文 題 名
DIFFERENTIAL Na+ ， K+ ― ATPase ACTIVITY AND CISPLATIN SENSITIVITY BETWEEN TRANSFOR:NiIANTS INDUCED BYH‑ ras AND THOSE INDUCED BYK‑ ras.
（H ‑ ras 癌 遺伝子とK‑ ras 癌遺伝子による形質変換細胞 に おけ る Na+ 、 K+ ―ATPase 活 性と シ スプ ラチ ン感受性）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
研究目的
シスプラチンは、泌尿器科領域の腫瘍を含め種々の癌の化学療法に広く用いられ、有 効な抗癌荊のーっと考えられている。しかし治療初期には有効であっても経過とともに 無効となぢ症例があり、臨床的に問題となってきている。近年、シスプラチン耐性機構 のーっとして、H‑ras癌遺伝子の関与が指摘されている。しかし、K‑ ras癌遺伝子もH‑
ras癌遺伝子と同様にシスプラチン耐性に関与するかどうか、またこれらra s癌遺伝子の 発現がどのような機序でシスプラチン耐性を誘導するのか、という点は不明であった。
そこで、H‑ras, K‑ras癌遺伝子により癌化したマウス線維芽細胞を用い、シスプラチン 感受性及び耐性に関わると考えられている因子を検討することにより、シスプラチン耐 性現象におけるras癌遺伝子の役割を明らかにした。
対韋及び方法
マウス線維芽細胞株NI H/3T3、ヒト活性化c．H‑ras癌遺伝子(EJ)により腫癌化した NIH/3T3であるEJ ‑NIH/3T3、v‑H‑ras癌遺伝子を含むHarveyマウス肉腫ウイルス欠損株 により腫癌化したNIH/3T3(Ha8‑21)、v‑K‑ras癌遺伝子を含むKirstenマウス肉腫ウイル ス欠損株により腫癌化したNIH/3T3(DT)、およびrat活性化c．K‑ras癌遺伝子により腫癌 化したNIH/3T3細胞株（1，8DNP2‑2‑5)を対象とした。各細胞株のシスプラチン感受性は，
clonog enic as sayにより検討した。対数増殖期の細胞を0‐20y,Mのシスプラチン中で1 時間培養し、細胞数を調整した後、 6‑welJ plateにまき、7‑12日後、生細胞を染色固定 し50細胞以上のコロニーを数えた。また対数増殖期の細胞を用い、各細胞株の細胞内 メタロチオネイン(M T)濃度、細胞内グルタチオン．S‑卜ランスフェラ―ゼ(GST)活性、
細胞膜Na+，K+ATP ase活性を測定した。細胞内プラチナ濃度測定には、原子吸光度計を 用 い 、 DNA polymerasepの 発 現 は northern blot法 に よ り 検 討 し た 。 なお，検定にはDunnettの多重比較検定法を用い、危険率5％で有意差ありとした。
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結果
（1 )H‑ras，K‑ras癌遺伝子発現細胞株のシスプラチン感受 性：H‑ras癌遺伝子発現細胞 株 で あ るEJ ‑NIH/3T3、Ha8‑21は 、そ の親 株NIH/3T3に比 べ、 各々4．1倍、2.4倍 シス プラ チンに酎性であったくpく0.01）。一方K‑ ra璃遺伝子発現細胞であるDTや1，8DNP 2‑2‑5は、
NIH/3T3との間でシスプラチン感受性に差を認めな かった
(2)細 胞 内MT濃 度 ：H‑ras癌 遺 伝 子 発 現 細胞 株、EJ ‑NIH/3T3，Ha8‑21はNIH/3T3に 比ベ 各 々3.7倍 ，3.9倍（pくO.01)MT濃 度の 増加 を認めたが、K‑ras癌遺伝子発現細胞株のう ち 1，8DNP 2‑2‑5も また3.5倍増 加し てい た（pく0．01)0一方 、DTは、NIH/3T3と比べ差を 認 めなかった。
(3)細 胞 内GST活 性 ． ：H‑ ras癌 遺 伝 子 発現 細胞 株中 、EJ ‑NIH/3T3はNIH/3T3に比 べ細 胞 内GST活 性 の 有 意 な 亢 進 を 認 め た 。 一 方 、Ha8‑21やK‑ rasj遺 伝 子発 現細 胞株 であ る1，8DNP 2‑2‑5、DTでは、NIH/3T3と比べ差を認めなかった。
(4)DNA polymerasepの 発 現 ：H‑ras発 現 細 胞 株 は 両 者 と も 、NIH/3T3と の 間 で そ の 発 現に差を認めなかった 。
(5)シ スプ ラチ ン33 ptMを投与した後の細胞内プラチナ濃度 ：H‑ras癌遺伝子発現細胞株 、 EJ ‑NIH/3T3とHa8‑21の 細 胞 内 プ ラ チ ナ 濃 度 は 各 々0．54+0. 24，0.50+O．23ng/mg proteinで あり 、NIH/3T3の1．77+0．67ng/mg proteinと比 べ有 意な 減少を認めた。一 方 K‑ ras癌遺 伝子 発現 細胞 株で ある1，8DNP 2‑2‑5やDTでは、有意な減少を認めなかった 。
（6） 細 胞 膜Na+，K+ATPase活性 ：EJ ‑NIH/3T3とHa8‑21の細 胞膜 分画 のNa十，K+ATPase 活 性は 各々2． 37+1.12，1.85+1.04mgPi/min/mgproteinで あり、NI H/3T3の3．87+2. 66 mgPi/min/mg proteinと 比 べ 有 意 な 減 少 を認 めた 。1，8DNP 2‑2‑5やDTで は、 有意 な減 少を認めなかった。
考案
今 回 の 検 討 か らH‑ ra塙 遺 伝 子 に よ り 癌 化 し たNIH/3T3細 胞 株 は 、 親 株 であ るNIH/
3T3よ ル シ ス プ ラ チン に耐 性で ある のに 対 し、K‑ ras発 現細 胞はNIH/3T3と 比べ 、シ ス プラ チン に対 する 感受 性に差がなく、H‑ ras癌遺伝子と異なり、K‑ras癌遺伝子はシスプ ラチン耐性に関与しないことが示された 。一般にH‑ras癌遺伝子とK‑ ra s癌遺伝子は機能 的に ほぼ 相同 の蛋 白質 ，ras p21をコ ード し、 細胞 内 情報 伝達 系の 異常 を生 じることで 細胞 を癌 化す ると 考え ら れて いる 。し かし 近年 、H‑ras癌遺伝子によルコ―ドされたras p21とK‑ ras癌 遺伝 子に よル コー ドさ れたras p21の間でC‑末端の アミノ酸配列に差があ るこ と、 またTPAに よるc．fosalt伝子 の誘導に差があることが示され、必ずしもH‑ras癌 遺伝 子とK‑ras癌遺 伝子 が同じ機能を有していないと考えられてき ている。そこでH‑raぷ 癌遺 伝子 とK‑ ras癌遺 伝 子発 現細 胞株 を用 い、 シスプラチン耐性 に関係していると考え ら れ て い る 因 子 に 差 が あ る か ど う か 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 細 胞 内 解 毒 系 であ るMTや GST、 ま たDNA修 復 酵 素 で あ るDNA polymerasepで は 、ras癌 遺 伝 子 発 現 細 胞 株 間 の シス プラ チン に対 する 感 受性 の差 を説 明し 得な かった。これに対 し、シスプラチンに耐 性を 示し たH‑ras発 現細 胞株 は、 いず れも シス プラ チ ン処 理後 の細 胞内 プラ チナ濃度の 有意 な低 下を 示し たが 、K‑ras発 現細 胞株 では その 低 下を 認め なか った 。こ の事実は、
H‑ ras癌遺伝子が関与するシスプラチン 耐性においても、他のシスプラチン耐性株同様、
取込 みの 差が シス プラ チ ン耐 性に 係わ る重 要な 因子と考えられた 。さらにシスプラチン の取 込み に係 わる と考 え られ てい る細 胞膜Na+，K+AT Pase活性の 低下をH‑ ras癌遺伝子 発現 細胞 株両 株で 認め た 一方 、K‑ras癌遺 伝子 発現 細 胞株 では 認め ず、 この 差がシスプ ラチ ンの 取込 みの 差、 さ らに シス プラ チン 感受 性の差を説明をす るものと考えられた。
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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 細 川 眞 澄 男
副 査 教 授 長 嶋 和 郎 副 査 教 授 小 柳 知 彦
学 位 論 文 題 名
DIFFERENTIAL Na+, K+ ‑ ATPase ACTIVITY AND CISPLATIN SENSITIVITY BETWEEN . '
TRANSFORIVIANTS INDUCED BY H ‑ ras AND THOSE INDUCED BY K ‑ ras.
（H ‑ ras 癌遺伝子とK‑ ras 癌遺伝子による形質変換細胞 におけるNa ゛、K ゛‑ ATPase 活性とシスプラチン感受性）
シス プラ チン は、 泌尿 器 科領 域の 腫癌 を含 め種 々の 癌の化学療法に広く用いられ 、有 効 な抗 癌剤 のー っと 考え ら れて いる 。し かし 治療 初期 には有効であっても経過とと もに 無 効と なる 症例 があ り、 臨 床的 に問 題と なっ てき てい る。近年、シスプラチン耐性 機構 の ーっ とし て、H‑ras癌遺 伝子 の関 与が 指摘 され てい る 。し かし 、K．ras癌遺 伝子 もH‑
ras癌遺 伝子 と同 様に シス プラ チン 酎性 に関 与す るか ど うか、またこれらras癌遺伝 子の 発 現が どの よう な機 序で シ スプ ラチ ン耐 性を 誘導 する のか、とぃう点は不明であっ た。
そ こで 、H‑ rasK*ras癌遺 伝子 によ り癌 化し たマ ウス 線 維芽 細胞 を用 い、 シス プラ チン 感 受性 及ぴ 耐性 に閲 わる と 考え られ てい る因 子を 検討 することにより、シスプラチ ン酎 性現象におけ るras癌遺伝子の役割を明ら かにした。
マウ ス線 維芽 細胞 株NIH/3T3、ヒ ト活 性化c．H‑ ras癌遺 伝子 （EJ)によ り腫 瘍化 した NIH/3T3で あ るEJ ‑NIH/3T3、v．H‑ras癌 遺 伝 子 を 含 むHa rveyマウ ス肉 腫ウ イル ス欠 損 株に より 腫瘍 化し たNIH/3T 3(Ha8‑21）｀v‑K‑ras癌 遺伝 子を 含むKirstenマ ウス 肉腫 ウ イル ス欠 損株 によ り腫 癌 化したNIH/3T3（DT）、およびrat活性化c．K‑ ras癌遺伝 子に よ り麗 癌化 したNIH／3T3細 胞株（1．8DN P2‑2‑5）を対象とした。各細胞株のシスプ ラチ ン 感受 性は ．clonogenic assayによ り検 討し た。 対数 増殖 期の 細胞 を0‑20いMのシ スプ ラ チン 中で1時間 培養 し、 細胞 数を調整した後、6． well plateにまき、7‑12日後、 生細 胞 を 染 色 固 定 し50細 胞 以 上の コロ ニー を数 えた 。 また 対数 増殖 期の 細胞 を用 い、 各細 胞 株の 細胞 内メ タロ チオ ネ イン（MT）濃度、細胞内グル タチオン‑S‑トランスフェラ ーゼ (GST)活 性 、 細 胞 膜Na+，K十AT Pase活 性を 瀾定 し た。 細胞 内プ ラチ ナ濃 度測 定に は、
原 子 吸 光 度 計 を 用 い 、DNApolyme rasepの発 現はno rthe rn blot法 によ り検 討し た。
H‑ ras．K‑ ras癌 遺伝 子 発現細胞株のシスプラチン感 受性につき検討した結果、H‑ras 癌 遺 伝 子 発 現 細 胞 株 で あ るEJ‑NIH/3T3、Ha8‑21は 、 そ の 親 株NIH/3T3に 比 べ 、 各 々 4.1倍、2.4倍 シスプラチンに耐性であった（p 0.01）。ー方K‑ ra s癌遺伝子発現細胞であ
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るDTや1，8DNP2‑2‑5は 、NIH/3T3と の 闘 で シ ス プ ラ チ ン 感 受 性 に 差 を 認 め な か っ た 。 こ の 結 乗 よ り 、H‑ras癌 遺 伝 子 と 異 な り 、K‑ ras癌 遺 伝 子 は シ ス プ ラ チ ン 酎 性 に 闘 与 し な い こ と が 示 さ れ た 。 そ こ で こ れ らras癌 遺 伝 子 発 現 細 胞 株 を 用 い 、 シ ス ブ ラ チ ン 耐 性 に 関 係 し て い る と 考 え ら れ て い る 因 子 に 差 が あ る か ど う か 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 細 胞 内 解 毒系であるメタロ チオ奉インやヶ．ルタチオン‑S‑トランスフェラーセ．、またDN A修復酵素であるDNAホ．リ メ ラ ― セ ．6で は 、ras癌 遺 伝 子 発 現 細 胞 株 間 の シ ス プ ラ チ ン に 対 す る 感 受 性 の 差 を 説 明 し 得 な か っ た 。 こ れ に 対 し 、 シ ス プ ラ チ ン に 酎 性 を 示 し たH． ras発 現 細 胞 株 は 、 い ず れ も 33 vMのシス プラチンを投与し た後の細胞内プラ チナ濃度が各々0.54+0.24，
0.50+0.23ng/mg proteinであり、NIH/3T3の1.77+0.67ng/mg proteinと比ベ有意
な 減 少 を 認 め た が 、K. ras発 現 細 胞 株 で は そ の 低 下 を 認 め な か っ た 。 さ ら に シ ス プ ラ チ ン の 取 込 み に 係 わ る と 考 え ら れ て い る 細 胞 膜Na十 ，K十AT Pase活 性 の 低 下 をH‑ras癌 遺 伝 子 発現細胞株で認め たが、K‑ ras癌遺伝 子発現細胞株では 認めなかった。
以 上 の 結 果 よ りras癌 遺 伝 子 に よ り も た ら さ れ る シ ス プ ラ チ ン に 対 す る 酎 性 は 、H‑
ras癌 遺 伝 子 に 特 異 的 で あ り 、 そ の 機 序 と し て こ の 遺 伝 子 に よ り 癌 化 し た 細 胞 株 で は 細 胞 膜Na+，K十AT Pase活 性 の 低 下 が み ら れ 、 そ れ に よ り 細 胞 内 へ の シ ス プ ラ チ ン の 取 込 み が減少しているた めと考えられた。
公 開 発 表 は 約20名 の 聴 衆 の 前 で 行 わ れ 、 細 川 教 授 よ り(DH‑ras癌 遺 伝 子 の 発 現 に よ ル シ ス7． ラ チ ン 酎 性 が 発 現 す る こ と は 示 さ れ た が 、 逆 に 一 般 的 な シ ス7． ラ チ ン 耐 性癌 細 胞株 では H． ras癌 遺 伝 子 の 発 現 亢 進 、 変 異 は み ら れ る か 、 ＠3種 類 のras癌 遺 伝 子(H． ，K． ，N‑） で 機 能 に 差 が あ る と す れ ば ど の よ う な 機 序 で も た ら さ れ る か 、 小 柳 教 授 よ り 臨 床 例 に お い て も 、 肺 、 リ ン ハ ． 節 、 原 発 巣 で シ ス7． ラ チ ン に 対 す る 反 応 性 に 差 が あ る が 、 こ れ はH‑ras癌 遺 伝 子 発 現 の 異 常 に よ り も た ら さ れ た も の か ど う か 、 長 嶋 教 授 よ り ＠ 親 株 を 他 の 細 胞 株 に か え て 、H‑ras癌 遺 伝 子 、K‑ ras癌 遺 伝 子 を 導 入 し て も こ の よ う に シ ス7． ラ チ ン 感 受 性 に 差 が で る の か ど う か 、 ＠H‑ ras癌 遺 伝 子 発 現 異 常 の 程 度 とNa十 ，K十 ．ATPase活 性 の 聞 に は 相 関 性 が あ る か ど う か 、 と い う 点 に 関 し て 質 問 が あ っ た 。 ま た 衛 生 学 斎 藤 教 授 よ り 、 細 胞 内 の シ ス7． ラ チ ン 濃 度 が 低 下 し て い るH‑ras癌 遺伝 子発 現 細胞 株で 、 細胞 内メ タ ロチ オネ イ ン濃 度の 増 加 は み ら れ た か ど う か 、 第 一 内 科 磯 部 助 手 よ ル シ ス7． ラ チ ン の 細 胞 内 か ら 外 へ の 排 出 機 構 は 検 討 し た か ど う か 、 と ぃ う 点 に 関 し 質 問 が あ り 、 発 表 者 は お お む ね 妥 当 な 回 答 を 行 っ た 。
審 査 員 一 同 は 、 本 研 究 に お い てras癌 遺 伝 子 間 で の 機 能 の 差 を 明 ら か に し た 点 、 お よ ぴH‑ ras癌 遺 伝 子 発 現 とNa十 ，K十 ．ATPase活 性 の 低 下 を 明 ら か に し た と ぃ う 点 で の 独 自 性 、 先 進 性 さ ら に 臨 床 へ の 応 用 の 可 能 性 を 示 し た 成 果 を 高 く 評 価 し 、 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 に 値 す る も の と 判 定 し た 。
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