博士（医学） 山本 貢 学位論文題名

     博士（医学）   山本   貢 学位論文題名

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ユ ビ キ チ ン 1 丿 ガ ー ゼ estrogen responslvenngerproteln    （ EFP ） の 細 胞 増 殖 に 及 ぼ す 影 響 と 作 用 機 序 の 解 析

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

【 背 景 と 目 的 】 ユ ピ キ チ ン 化 は タ ン バ ク 質 の 翻 訳 後 修 飾 の ー つ で あ り ， 細 胞 周 期 制 御 ， シ グ ナ ル 伝 達 ， 癌 抑 制 遺 伝 子 の 発 現 調 節 な ど の さ ま ざ ま な 生 体 内 の 重 要 な 機 能 を 司 っ て い る ． ユ ピ キ チ ン は ， ユ ビ キ チ ン 活 性 化 酵 素(El） に 転 移 さ れ ， ユ ピ キ チ ン 結 合 酵 素(E2)を 介 し て 最 終 的 に ユ ピ キ チ ン リ ガ ー ゼ(E3)に よ っ て 認 識 さ れ て い る 基 質 夕 ン パ ク 質 に 付 加 さ れ る ． 基 質 夕 ン バ ク 質 上 に4つ 以 上 の ポ リ ユ ピ キ チ ン 鎖 が 形 成 さ れ る と プ 口 テ ア ソ ー ム に よ り 認 識 さ れ 分 解 さ れ る ， 基 質 夕 ン バ ク 質 を 認 識 ・ 結 合 す るE3は 多 数 存 在 し て お り ， そ の う ち の い く つ か は腫 瘍 の 発 生 機序 に 深 く 関 係し て い る ．

  Estrogen‑responsive finger protein (EFP)は ， そのmRNAの3 非 翻 訳領 域 にestrogen receptor (ER)結 合 部 位 で あ るestrogen‑responsive element (ERE)を 持 ち ， エ ス ト 口 ゲ ン に よ り そ の 発 現 レ ベ ル が 調 節 さ れ る 一 次 応 答 夕 ン パ ク 質 で あ る ，EFPは630ア ミ ノ 酸 で 構 成 さ れ ，N末 端 にRINGフ ィ ン ガ ー ド メ イ ン を 持 つ ，RINGフ ィ ン ガ ー ド ヌ イ ン は 環 状 構 造 の 中 に2n2゛ を 配 位 し た 特 徴 的 な 構 造 を し て お り ， ユ ピ キ チ ン リ ガ ー ゼ 活 性 を 示 す タ ン バ ク 質 の 多 く が 有 す る モ チ ー フ で ，EFPもE3で あ る こ と が 知 ら れ て い る ．EFPは ェ ス ト 口 ゲ ン 依 存 性 細 胞 増 殖 と 生 殖 器 官 の 正 常 の 発 生 に 不 可 欠 と 報 告 さ れ て い る ．EFPは 正 常 乳 腺 と 比 較 し て 授 乳 期 乳 腺 と 良 性 腫 瘍 で 高 発 現 し て い る が ， 乳 癌 で は 逆 に 発 現 は 低 下 し て お り ， 乳 腺 組 織 の 分 化 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る と 考 え ら れ る ． ま た ， 正 常 組 織 で はERの 発 現 とEFPの 発 現 は よ く 相 関 す る が ， 乳 癌 組 織 で は 両 者 の 発 現 に 相 関 を 認 め な い ， こ れ は 乳 癌 細 胞 で はEFPの 発 現 量 が エ ス ト 口 ゲ ン の コ ン ト 口 ー ル か ら 外 れ て い る こ と を 示 し て お り ，EFPが 癌 化 の メ カ ニ ズ ム に 関 与 し て い る 可 能 性 を 示 唆 し て い る ．Uranoら は ，EFPは14−3‑3aを ユ ピ キ チ ン 化 し 分 解 を 促 進 す るE3で あ り ，G2停 止 を 引 き 起 こ すnegative regulatorで あ る と 報 告 し た ， 同 時 にEFP を ノ ッ ク ダ ウ ン し た 乳 癌 細 胞 で は 増 殖 が 抑 制 さ れ ，EFPの 過 剰 発 現 し た 乳 癌 細 胞 で は エ ス ト 口 ゲ ン 非 依 存 性 増 殖 を 示 す こ と も 報 告 し て い る ． こ れ はEFPが 細 胞 増 殖 に 対 し て 促 進 的 に 働 き ， エ ス ト ロ ゲ ン に よ る 増 殖 コ ン ト 口 ー ル を 仲 介 し て い る こ と を 示 し て い る ．   乳 癌 は ェ ス ト ロ ゲ ン 依 存 性 増 殖 を 示 す 代 表 的 な 腫 瘍 性 疾 患 で あ り ，ER発 現 が 認 め ら れ る 乳 癌 患 者 に は ， エ ス ト ロ ゲ ン レ ベ ル を 低 下 さ せ る ， ま た は エ ス 卜 口 ゲ ン に 対 す る 競 合 的 阻 害 薬 を 投 与 す る 内 分 泌 療 法 が 行 わ れ る の が 一 般 的 で あ る ． し か し ， そ の 大 部 分 は い ず れ 内 分 泌 療 法 に 対 し て 耐 性 を 獲 得 す る ， し た が っ てEFPの 機 能 解 明 は 腫 瘍 発 生 機 序 の 解 明 の み な ら ず ， 内 分 泌 療 法 に 対 す る 耐 性 獲 得 機 序 の 解 明 に も っ な が る 可 能 性 が あ る ．

【 材 料 と 方 法 】 細 胞 培 養 ：T‑47D細 胞 及 びHeLa S3細 胞 は ，10％FCS含 有DMEMを 用 い て 培 養 し た ， エ ス ト ロ ゲ ン 不 含 状 態 で は ，Charcoal/Dextr．an処 理FCSを 含 むDMEM（ フ ェ ノ ー ル レ ッ ド 不 含1で48時 間 培 養 し て か ら 使 用 し た ．RNAi：EFPの 発 現 抑 制 に はsiRNAに よ る RNAiを 用 い た ．EFP cDNAの711‑729領 域 を 対 象 と し たshRNAを デ ザ イ ン し ，PCR法 を 行 っ た ． 遺 伝 子 導 入 ：T‑47D細 胞 お よ びHeLa S3細 胞 へ の 遺 伝 子 導 入 は レ 卜 口 ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い て 行 っ た ．HEK293T細 胞 お よ び 免 疫 螢 光 染 色 の 際 のHeLa S3細 胞 へ の 遺 伝 子 導 入 は り ン 酸 カ ル シ ウ ム 法 を 用 い て 行 っ た ，SDS‑PAGEお よ び ウ ェ ス タ ン プ 口 ッ テ ィ ン グ 法 ： 細 胞 溶 解 バ ッ フ ァ ー に よ り 細 胞 抽 出 液 を 調 整 し ，SDS‑PAGEを 行 っ た ．enhanced chemiluminescence systemで 検 出 ，NIH imageに よ り 定 量 化 し た ． 細 胞 増 殖 ア ッ セ イ ：96ウ

‑ 95一

エ ル プ レ ー ト に 細 胞 を 播 種 し ，O，24，48及 び72時 間 後 に 細 胞 数 の 計 測 を 行 っ た ． コ 口 ニ ー ア ッ セ イ ：0.53％ ポ ト ム ア ガ ロ ー ス の 上 にT‑47D細 胞 混 合0.4％ ト ッ プ ア ガ 口 ー ス を 凝 固 さ せ て 培 養 を 行 い ，14日 目 に 長 径100山 以 上 の コ ロ ニ ー を 計 数 し た ， 免 疫 螢 光 染 色 ： カ パ ー グ ラ ス の 上 でHeLa S3細 胞 を 培 養 し ，HA‑EFPを 遺 伝 子 導 入 し た ．2％ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 で 固 定 し た 後 ， 一 次 抗 体 お よ び 二 次 抗 体 で 反 応 さ せ ， 最 後 に 核 染 色 を 行 っ た ， 一 次 抗 体 に は 抗HA抗 体 お よ び 抗p27抗 体 を 用 い た ．RT‑PCRお よ びqPCR：HeLa S3細 胞 よ りRNAを 抽 出 しRT‑PCRお よ びqPCRを 行 っ た ．

【 結 果 】ERaの 発 現 し て い る 乳 癌 細 胞Tー47Dに ，FLAG‑EFPを 導 入 し 発 現 さ せ ウ ェ ス タ ン 解 析 を 行 っ た と こ ろ ， 内 在 性EFPと ほ ぼ 同 量(93％ ） のFLAG‑EFPの 発 現 が 認 め ら れ た ， 同 様 に siRNAを 導 入 し た 細 胞 を 作 製 し ，EFPの 発 現 量 を ウ エ ス タ ン 解 析 し た と こ ろ ， 著 明 な 発 現 量 減 少(39％ ） が 認 め ら れ た ． 次 に 作 製 し た 細 胞 株 を 用 い て 細 胞 増 殖 ア ッ セ イ を 行 っ た ， そ の 結 果 ， コ ン ト 口 ー ル 細 胞 と 比 較 し て ，EFP過 剰 発 現 細 胞 で は 増 殖 が 抑 制 さ れ ， ノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 で は 増 殖 促 進 が 認 め ら れ た ． エ ス ト 口 ゲ ン 不 含 状 態 で も 同 様 にEFP過 剰 発 現 細 胞 で は 増 殖 が 抑 制 さ れ ， ノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 で は 増 殖 促 進 が 認 め ら れ た ．EFPは14‑3‑3aを 分 解 し て 細 胞 増 殖 を 促 進 す る こ と が 既 に 知 ら れ て い る が ， 本 実 験 で は 逆 の 結 果 と な り ，EFPの 別 の 機 能 の 存 在 が 予 想 さ れ た ． ま た 、 こ の 機 能 に は エ ス ト ロ ゲ ン は 関 与 し て い な い 可 能 性 が 考 え ら れ た ， 軟 寒 天 培 地 を 用 い た コ ロ 二 一 ア ッ セ イ で は ，EFP過 剰 発 現 細 胞 で コ ロ ニ ー 形 成 が 抑 制 さ れ ノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 で コ 口 二 ー 形 成 が 促 進 さ れ て お り ，EFPはanchorage‑independent growthに 対 し て 抑 制 的 に 作 用 す る と 考 え ら れ た ．EFPの 細 胞 周 期 に お け る 作 用 を 調 べ る た め に ウ エ ス タ ン 解 析 を 行 い ，EFP過 剰 発 現 細 胞 で はMycの 発 現 量 減 少 が 認 め ら れ ， 一 方 ， p27や14‑3‑3aの 発 現 量 増 加 が 認 め ら れ た ，EFPノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 で は 逆 にMycの 発 現 量 増 加 が 認 め ら れ た が ，p27と14‑3‑3aの 変 化 を 確 認 す る こ と は で き な か っ た ． こ の 結 果 は エ ス ト 口 ゲ ン 非 存 在 下 で も 同 様 で あ っ た ．

  そ こ でERaを 発 現 し て い な いHeLa S3細 胞 を 用 い て 解 析 を 行 っ た 結 果 ，HeLa S3のEFP 過 剰 発 現 細 胞 で も 同 様 に 細 胞 増 殖 は 抑 制 さ れ て お り ，Mycの 発 現 量 減 少 とp27の 発 現 量 増 加 が 認 め ら れ た が ，14‑3‑3aの 発 現 量 に は 変 化 が 認 め ら れ な か っ た ． し た が っ て ，EFPはMyc あ る い は そ の 上 流 の シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 対 し て 作 用 し て い る と 推 測 さ れ た ． ま た そ の 作 用 機 序 に は ェ ス ト 口 ゲ ン は 関 与 し て い な い ， も し く は 関 与 し て い て も 必 須 で は な い と 考 え ら れ た ．   RT‐ PCRお よ びqPCRを 行 い ，Mycとp27のnlRNA量 を 計 測 し た と こ ろmRNA量 に 変 化 を 認 め な か っ た ． し た が っ て ，EFPはMyc及 びp27の 合 成 量 に は 影 響 を 与 え て お ら ず ， 分 解 量 を 変 化 さ せ て い る こ と が 示 唆 さ れ た ．

【 考 察 】 本 報 告 で はEFPを 過 剰 発 現 し た 細 胞 で は 細 胞 増 殖 速 度 が 抑 制 さ れ る こ と を 明 ら か に し た ，ERdが 発 現 し て い るT‐47D細 胞 の み な ら ず ，ERaの 発 現 し て い な いHeLaS3細 胞 で も 同 様 の 結 果 で あ っ た こ と か ら ， こ の 機 序 に 対 し て エ ス ト ロ ゲ ン は 関 与 し て い な い ， あ る い は 関 与 は し て い て も 必 須 で は な い と 考 え ら れ る ， こ の 結 果 はUranoら の 報 告 と は 異 な る が ， 乳 癌 組 織 で はEFPの 発 現 が 低 下 し て い る こ と か ら 考 え る と ， む し ろ 合 理 的 と 考 え ら れ る ． し か し 一 方 で ，EFPが 乳 癌 （invasiveductalcarcinoma） で 高 発 現 し て い る と い う 報 告 も あ り ， 一 元 的 に 考 え る こ と は で き な い 可 能 性 も あ る ．

  次 にCyclinC，CyclinE，CyclinBを そ れ ぞ れ 制 御 し て い るMyc，p27及 び14．3−30の 発 現 量 を 調 べ る と ，EFPはMycを 減 少 さ せp27を 増 加 さ せ て い る こ と が 判 明 し た ． こ れ は 細 胞 周 期 制 御 の シ グ ナ ル 伝 達 に お い てEFPの 作 用 点 がMycか ， あ る い は よ り 上 流 で あ る こ と を 示 し て い る ．Mycお よ び p27の 発 現 量 変 化 に はndボA量 の 変 化 は 伴 っ て お ら ず ， 夕 ン バ ク 質 合 成 で は な く ， 分 解 量 の 変 化 を 反 映 し て い る と 考 え ら れ る ．

  今 後 は ，EFPがMycと 直 接 結 合 し て い る の か ，EFPはMycを ユ ビ キ チ ン 化 し て い る か ， Mycの 減 少 に プ 口 テ ア ソ ー ム が 関 与 し て い る か な ど を 検 討 し て い く 必 要 が あ る ． 最 終 的 に は ，EFPの 細 胞 周 期 制 御 に 関 す る 機 能 を 解 明 す る こ と で ， 乳 癌 の 発 生 機 序 ， エ ス ト 口 ゲ ン 依 存 性 の 獲 得 ・ 消 失 に 関 わ る 新 た な 知 見 が 期 待 で き る か も し れ な い ．

【 結 諭 】 あ る 種 の 細 胞 系 列 に お い て は ，EFPは 細 胞 増 殖 に 対 し て 抑 制 的 に 作 用 し て い る こ と が 判 明 し た ．EFPはMycを 減 少 さ せ ，p27を 増 加 さ せ て い た が ， 両 者 のmRNA量 に は 変 化 を 与 え て お ら ず ， 合 成 で は な く ， 分 解 を 制 御 す る こ と が 明 ら か と な っ た ．

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学位論文審査の要旨 主 査    教 授    田 中 伸哉 副 査    教 授    平 野    聡 副 査    教 授    武 冨 紹信 副査   准教授    神山俊哉

学 位 論 文 題 名

     ．    ． r 丶    」    ．

ユ ビ キ チ ン リ ガ ー ゼ estrogen responslvenngerproteln    （ EFP ） の 細 胞 増 殖 に 及 ぼ す 影 響 と 作 用 機 序 の 解 析

  Estrogen‑responsive finger protein (EFP)は、エストロゲンによりその発現レベルが調節さ れる一次応答分子である。EFPは14‑3‑3「をユビキチン化し分解を促進するユビキチンリガ ーゼであり、細胞増殖を促進し、EFPの過剰発現した乳癌細胞ではエストロゲン非依存性増 殖 を示す と報告さ れている。これはEFPがエストロゲンによる増殖コントロールを仲介し ていることを示している。一方、乳癌組織でのEFPの発現量、Estrogen‑receptor(ER)や14‑3‑3 aの発 現との相 関は一定 の結果 となって おらず 、一元的には説明困難である。そこでEFP の 他の機 能の探索 、および細胞増殖におけるEFPの位置づけを明らかにするため、今回の 研究を行った。

  ま ずER陽 性 乳癌 細 胞T‑47Dに レ ト ロウ イル スベク ターを用 いてEFPおよびsiRNAを 遺 伝子導入し過剰発現(193％）およびノックダウン(39％）の安定変異株を作成した。細胞増殖ア ッセイの結果、EFP過剰発現細胞では増殖が抑制され、ノックダウン細胞では増殖促進が認 められた。コロニーアッセイでは、EFP過剰発現細胞でコロニー形成が抑制されノックダウ ン細胞でコロニー形成が促進されており、EFPはanchorage‑independent growthに対しても抑 制 的に作 用すると 考えら れた。ウ エスタン 法による解析では、EFP過剰発現細胞でMycの 発 現量減 少が認め られ、p27および14‑3‑3aの発現量増加が認められた。EFPノックダウン 細 胞では 逆にMycの発現量増加が認められたが、p27と14‑3‑3aの変化を確認することはで きなかった。以上の結果はエストロゲン非存在下でも同様であり、この機能にはエス卜ロゲ ンは関与していないか、必須ではないと考えられた。この結果は既知の知見とは異なるが、

乳 癌組織 でEFPの 発現が 低下して いるとい う報告もあり、むしろEFPが増殖を抑制する方 が 合理的 とも考え られる 。ERを発現 してい ないHeLa S3細胞でも同様にEFP過剰発現細胞 を 作成し アッセイ を行っ たところ 、細胞増 殖が抑制され、Mycの発現量減少とp27の発現 量増加が認められたが、14‑3‑3csの発現量には変化が認められなかった。EFPはMycあるい は その上 流のシグ ナル伝 達経路に 対して作 用していると推測された。RT‑PCRおよびqPCR を 行 い 、Mycとp27のmRNA量を 計 測 した と こ ろmRNA量 に 変 化 を認 め なかっ た。した が っ て、EFPはMyc及びp27の合成 量には影 響を与 えておら ず、分 解量を変 化させているこ と が示唆 された。EFPとMycのin vivo binding assayを行い、EFPとMycが結合しているこ とを明らかにした。

  ある種の細胞系列においては、EFPは細胞増殖に対して抑制的に作用していることが判明 し た 。EFPはMycを 減 少さ せ 、p27を 増加 させ ていた が、両者 のmRNA量に は変化を 与え て おらず 、合成で はなく 分解を制 御してい ることが示唆された。EFPはMycと結合するこ と が明ら かとなり 、今後、Mycをユビキチン化しているかどうかを明らかにすることが期 待された。

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公 開 発 表 後 、 副 査 の 平 野 教 授 よ り1） ユ ビ キ チ ン リ ガ ー ゼ の 種 類 、2冫 乳 癌 とERと の 関 連 、 3） 乳 癌 とEFPと の 関 連 、4冫 ユ ビ キ チ ン と 癌 化 と の 関 連 、5） 今 回 の 結 果 が 既 知 の 報 告 と 異 な っ た こ と の 理 由 に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 そ れ に 対 し て1） 正 確 に は わ か ら な い が 数 百 種 類 、 2)80％ 陽 性 だ が ホ ル モ ン 療 法 無 効 例 も あ る 、3） 臨 床 の 報 告 は 一 定 し て お ら ず 関 連 は 不明 、5） 癌 種 に よ り 異 な る 、5） 細 胞 種 の 違 い に よ る と 考 え て い る 等 の 回 答 が あ っ た 。 主 査 の 田 中 教 授 か ら はDMycとp27に 注 目 し た 理 由 、2） 複 数 の 細 胞 株 で 調 べ た か 、3)EFPとMycの 結 合 は ユ ビ キ チ ン 化 に 必 要 な の か 、4） 使 用 し た 細 胞 のERの 発 現 は 確 認 し た か 、5)survivala8say な ど 他 の ア ッ セ イ は 行 っ た か 、6） 臨 床 検 体 でEFPの 発 現 を 確 認 し た か に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 そ れ に 対 し て1） ま ず 大 ま か な 当 た り を っ け る た め に 選 択 し た が 偶 然 結 合 が 認 め ら れ た 、2）T47DとHeLaの2種 類 で 確 認 し た 、3） 複 合 体 を 形 成 し 直 接 結 合 で な い こ と も あ る が 結 合 は 必 要 、4）5） 今 回 は 行 っ て い な い 、6） 今 後 行 い た い 等 の回 答 が あ っ た。 ま た 、 副 査の 武 冨 教 授 よ り1） 導 入 し たEFP遺 伝 子 に はEREを プ ロ モ ー タ ー と し て 用 い た の か と の 質 問 に 、 1） 用 い て い な い と の 回 答 が な さ れ 、ERの 有 無 に よ る 違 い を 検 証 し た こ と に は な ら な い の で は な い か と の 指 摘 が あ っ た 。

こ の 報 告 はEFPが 細 胞 増 殖 を 抑 制 し 、Mycと 結 合 す る こ と を 示 し た 初 め て の 報 告 で あ り 、 EFPの 細 胞 増 殖 に お け る 位 置 づ け の 解 明 に 寄 与 す る も の と 思 わ れ た 。

審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 単 位 取 得 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

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