博士（医学）畠山鎮次 学位論文題名
マウスリンパ組織におけるFgr 発現とその関連分子の研究
学位論文内容の要旨 I ．緒言
細 胞 内蛋 白 質 のチ ロ シン 残 基 のり ン 酸 化反 応 は， 細 胞 の活 性 化及 び増 殖反応と 腫 瘍 細 胞に おける 形質転換 に関与し ている． 非受容体型 のプロテ インチロ シンキナ ー ゼ(PTK)であるsrc‑familyは， 血液系及 びりンパ 系細胞に 発現が高く，それらの細胞 の活性化及び分化の制御に関与していることが示唆されている．
癌遺伝子y‐ fgrま，最初にGarlner一RaSheedfelmesarc（）mavlrusより分離された．その 後 ， これ はーfamilyに 属し，そ の遺伝子 産物Fgrは，PTK活性を有す ることが 判明し た ． その 癌 原 遺伝 子 であ るc脅 は ，単 球， マクロファ ージ，好 中球，ナ チュラル キ ラ ー（NK）細胞 ，及びEps忙in‐Barrv洫s感染B細胞に発 現されている．Fgrは免疫グ ロ プリンGFc受容 体u型（Fc弧uI）と結合していることが，ヒトにおいて報告されてい る ．しかし，マウスにおいてはFgrの機能，組織分布，会合分子など不明な点が多い．
本研 究 において ，Fgrの発現 及びその 関連分子 を解明する ために， まずマウ スFgr に 対 す る モ ノ ク ロナ ー ル 抗体 （mAb） 俎2を 作 成し た ．こ の2H2を使 用 し，lmmune compleXkmaSeassり，及 ぴ免疫組 織化学的 手法によ って，種 々の組織に おけるFgr発 現 を 検 索 し た ． さら に ， 免疫 沈 降法 に よ りFgrと 結合 し て いる 分 子 を同 定 した ・
IL材 料 と 方 法
抗 ヱ空 丞Fgr佳 堕 往 製： マ ウスc‑fgr cDNAを合成す るための 適当なプ ライマーを 使 用して，RT‑PCR法にてマウ ス腹腔細胞からc‑fgr cDNAを得，それをpMAIー−c2ベク タ ーに組み 込み，Fgrとマ ルトース 結合蛋白 との融合 蛋白質を得た．それをマウスに 免 疫し，Fgrの ユニーク領 域を認識 する単ク ローン抗 体2H2 (IgG1，K）を作製した．
免 疫 沈 隆 法 ： ラ ク ト ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 法 に よ りNa125Iで 細 胞 表 面 標 識 し ， lo/oNP‑40ま たはl%Brij96を使 用して可溶 化し，そ の上清に 各抗体とプロテインハセ フ ァ ロ ー ス ピ ー ズ ま た は ， プ ロ テ イ ンG‑ア ガ ロ ー ス ビ ー ズ を 反 応 さ せ た 後 ， SDS‑PAGEを行った．
迦vitrQ kinase assay：非標識下の細胞より免疫沈降を行い，洗浄後のビーズにキナ ー ゼ 用 緩 衝 液 と ［ ア‑32P］ATPを 加 え て 反 応 さ せ ，SDS‐PAGEを 行 っ た ・ 垈Z王 ピ 翌2壁ZZ：mviロ0bnaSeassay後 の ゲ ル よ り 目 的 の 部 分 を 切 り 出 し ， 50mM炭 酸 ア ン モ ニ ウ ム 中 で ホ モ ジ ェ ナ イ ズ し ，V8プ ロ テ ア ー ゼ を 反 応 さ せ ， SDS‐n6ぬEを行った．
免 疫組繊iヒ 掌染色：各 組織を凍 結し，厚 さ5メmで薄 切後，冷アセトンで固定した・
そ の後ビオ チン化2H2抗体 を反応さ せ，さら にアビジ ン‐ピオチン化ベルオキシダー ゼ複合体と反応させ，DABで発色させた．
m． 結 果
造 血 丞及 垈 リZZ！ 丞組 繊 睦 蔓tr士墨Fgr現：マ ウスの造 血系およ ぴりンパ 系組織由 来の 細胞溶解 液におい て，2H2を使 用して血vitroキ ナーゼ反 応を行うと，Fgrはりン パ 節 に最 も 高く，脾臓 が次に高 く，胸腺 や末梢血 にもわず かながら 発現が認め られ た． しかし， この方法 によって は，骨髄に はFgr発現は 認められ なかった．またりン パ 節 よ りMac‑l陽 性 細 胞 を 調 整 し ，2H2mAbを 用 い て 免 疫 染 色 を 行 っ た と こ ろ ， Mac‑l陽性細胞にFgrの発現が認められた・
ヱ空 墨リZZ！組 繊睦担t士 墨Fgr現堕免 疫組繊iヒ堂 的鰹蚯： 脾臓においては白脾髄 周 囲 の辺 縁 帯に，リン パ節にお いては傍 皮質領域 と髄質に ，陽性所 見が得られ た．
リ ン 杢 変4Z活 性 化 圭 霊‑ (LAK細 胞 睦 担 ！ 士 墨Eg鑑現 ： マ ウスLAIく細 胞 で2H2 mAbを用 いてin vitroキナ ーゼアッ セイを行 うと，胸腺 と比較し て非常に高い発現が 認められた・
ヱ空 丞腫癌細 胞！三塑t j墨Fgr現：血液系及ぴりンパ系細胞由来の腫瘍細胞を使用 し て ，2H2によ る面vitroキナー ゼアッセ イを行う と，マク ロフアー ジ／単球 系以外 の腫瘍細胞にもFgrの発現が認められる結果が得られた．
活性iヒ細胞！三担！士墨Eg￡発現：B細胞及ぴ腹腔細胞はLPSで，T細胞はPMA，カルシ ウム イオノフ オア，及 ぴ抗Thy‑l抗体 を用いて刺 激すると ，いずれの細胞も刺激前に はFgrの発 現 は認 め ら れな い が ，刺 激 後はFgrの 発現 が 認め ら れ るよ うに なった．
ヱ 空 丞Fgr壬 と 結 盒し 至 ！！ 墨 細 胞表 面 盆壬 ： マ ウス マ クロ フ ア ージ 様 細 胞を Na125Iで表 面標識し ，その細 胞溶解液を2H2mAbによって免疫沈降した．PU5―1.8細胞 に お いて は75kDa，J774.1細胞にお いては主 要な75kDa，80kDaの 他，幾っ かのFgrと の会合蛋白質が認められた・
Ly6C盆 壬 睦 結 盒L玉v)墨Fgr壬 ：面vitroキ ナ ーゼ ア ッ セイ に よりLy6C分 子 との 共沈 物に，Fgrと 同様の分 子量のり ン酸化蛋白 質が認め られたが ，FcyRII分子にはヒ トの 場合と異 なり，Fgrと 考えられ るキナーゼ 活性を有 する分子 の共沈が認められな か っ た． さ らに2H2と 抗Ly6C抗 体 によ る 免 疫沈 降 物 の1次 元 ペ プチ ド マップ パター ン は 一致 し た． 従 っ て，Ly6C分 子と 結 合 して い る 分子 は ，2H2mAbに よって認 識さ れる 分子と一 致，即ちFgrであるこ とが判明し た．また ，正常リ ンパ節細胞を用いて も同様の結果が得られた・
IV.結 論 と 考 察
免 疫 組織 化 学， 免 疫 複合 体 キナ ー ゼ アッ セ イなどに より，Fgrは 主にマク ロフアー ジ 系 細胞 ，LAK細 胞 等 に陽 性 であ っ た ．し か し，休止状 態では発 現が認め られない T，B細 胞 など の り ンパ 系 細胞 で も 活性 化 に 伴いFgr発現が 認められ ，また腫 瘍細胞 に お い て も マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 列 以 外 の 由 来 の 細 胞 にFgr発 現 が 認 め ら れ た ． Fgr分 子と 共 沈す る 分 子は ， 特に75kDaの 分 子 がそ の 主要 な 成 分を 成 して いた． 今 回 用 いた マ ウス のシステ ムでは， ヒトで報 告されてい るFc7RIIとの結 合は認め られ な か った ． これ は，アミ ノ末端の ユニーク 領域におけ るアミノ 酸配列が ，ヒトと マ ウス で大きく 異なること が一因と 推定され た．
また 既存の表 面分子とFgrの 結合を検 索する過 程で，抗Ly6C抗体を用いた免疫複合 体キ ナーゼア ッセイによ りLy6CがFgrと結 合してい ることが 判明した ．この結果は，
Ly6Cを 介す る 細胞内 シグナル 伝達にFgrが 関与する 可能性を示 唆する．Fgrほ主に自 然 免 疫を 担 当す る細胞に 多く発現 するが，Fgrと結合する 分子の検 索は，前 述のFgr 発現 部位・細 胞のデータ と共に，Fgrの役割， 特に非特 異的認識 に関与する分子機構 を知 る上で， 今後重要と 考えられ た．
学位論文審査の要旨 主査 教授 小野江和則 副 査 教授 葛巻 暹 副 査 教授 柿沼 光明
学 位 論 文 題 名
マウスリンパ組織における Fgr 発現とその関連分子の研究
細胞内蛋白質のチ口シン残基 リン酸化は、細胞の活性化、増殖、形質転換などに、関与してい る。非受容休型のプロテインチ口シンキナ―ゼ（以下PTK)であるsrc−familyは、造血系細胞に発 現が高く、免疫系細胞のシグナル伝達に直接関与レていることが、次々と判明している。src ‑fa milyに属し、PTK活性を有するFgrは、ヒ卜では単球、マク口ファ―ジ、好中球、ナチュラルキ ラ一細胞に発現しており、免疫 グ口プリンのFcYII型レセプターと結合していることが報告され ているが、マウスにおいては、Fgrの機能、組織分布、会合分子など、ほとんど明らかにされて いない。
本論文は、マウスFgr分子のユ二一ク領域に対する単ク口 ―ン抗体（2H2)を樹立し、Fgr陽性 組織、細胞を同定し、さらにFgrとの会合分子を明らかにした。先ず、in vitroキナーゼ反応に よって、Fgrはりンパ節、脾臓の順に強く発現するが、胸腺、末梢血では弱く、骨髄には認められ ないことが判明した。また、免 疫組織化学的検索の結果、リンパ節では傍皮質、髄質、牌臓では 辺縁帯のマクロファ→ジが、特 異的に2H2陽性であった。従 って、マクロファージの一部がFgr を発現すると考えられた。しか し、刺激後の活性化の状態では、マク口ファージのFgr発現fま増 強し 、 さら にT細胞、B細 胞にもFgrの発現が新たに認 められた。また、IL―2で誘 導したLAK細 胞も、Fgr強陽性であった。さらに、一部の例外を除き、多くの造血系腫瘍細胞にもFgrの発現が 認められた。したがってFgrの発現は、レスティングの状態では単球、マク口ファ―ジ系細胞亜 群に限定されるが、細胞が活性 化、または形質転換した状態では、リンパ系細胞にも認められる ことが判明した。
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次にFgrと会 合している分子を明らかにするため、ヨードで細胞表面を標識し、細胞溶解後、
2H2抗体で免疫 沈降したところ、分子量75kDaの蛋白を中心として、幾っかの分子が同定された
。これらのFgr会合分子の中に、ヒ卜で認められたFcYII型レセプターは認められなかった。こ のようにヒ卜とマウスでFgrとの会合分子が異なるのは、Fgrのユニーク領域のアミノ酸配列が
、種によって大きく異なることに起因すると考えられた。しかし、抗Ly6C抗体との共沈分子の中 に、2H2と反応 する分子が同定され、これらはべブチドマップパターンの解析により、Fgrと同定 された。
論文発表に際し、葛巻教授より、2H2抗体の特異性、FgrとLy6Cとの会合は腫瘍細胞で見てい るが正常細胞でも認められるか、柿沼教授より、PIリンカ一型細胞表面分子が、ミリスチン酸で 結合している分子と結合する可能性、報告について、またその際のアダプタ一分子の関与につい ての御質間があったが、本人は的確に解答しえた。また、葛巻、柿沼両教授より個別に御審査い ただき、合格と判定された。
以 上、 本論文はマウスFgr分子の発現、分布などの詳細を明 らかにし、ヒ卜とマウスてはFg rとの会合分子 が異なり、マウスFgrはLy6Cと会合することを始めて明らかにした。また、今回 の研究により、T細胞におけるLck，Fyn，B細胞におけるLyn，Blkで明らかになったように、非特 異免疫に関与すると考えられる、免疫系細 胞の細胞内シグナル伝達に重要な分子のーっが、Fgr で あ る こ と が 判 明 し た 。 従 っ て 本 論 文 は 、 博 士 の 学 位 に 相 当 す る と 判 定 し た 。
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