博 士 （ 獣 医 学 ） 加 藤 明
学 trL 論 3t 題名
24R,25‑Dihydroxyvitamin D3 : a vitamin D3 metabolite essential for the healing process of a fracture and the evidence for its membrane receptor in fracture healing tissue
（骨折治癒におけるビタミンD3 代謝物24R 25‑ ジヒドロキシ ビタミンD3 の役割とその受容体に関する研究） ．
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
ビ タ ミ ンDの 生 物 学 的 作 用 は 、 摂 取 さ れ た コ レ ス テ ロ ー ル が 皮 膚 に て ブ レ ビ タ ミ ンD3を 経 由 し て ビ タ ミ ンD3に 変 換 さ れ 、 さ ら に 肝 臓 と 腎 臓 で 水 酸 化 反 応 を 受 け た 後 に 発 揮 さ れ る こ と が 知ら れて いる 。1a,25‑dihydroxyvitaminDヨ[1a，25(OH)：Dユ］は代表的な活性型ビタ ミンDユ代謝物であ り 、 こ れ に 対 応 す る 核 内 受 容 体 に つ い て も 広 く 研 究 が 行 な わ れ て い る 。 一 方 、24R，25‑
dihydroxyvitamin D3 [24R．25(OH)ZD3]は、1a，25(OH)2D3と は異なる部位に水酸基が 導入された代謝物 で あ る が 、 血 漿 中 に 高 濃 度 で 存 在 す る に も か か わ ら ず 、 こ の 代 謝 物 の 生 物 学 的 役 割 は ま だ 充 分 に は 解 明 さ れ て い な い 。 本 研 究 で は 、 骨 に お け る24R,25(OH)2D3の 生 物 学 的 役 割 に つ い て 、 二 ワ ト り に お け る 骨 折 治 癒 の 実 験 モ デ ル を 用 い て 確 定 し 、 更 に こ の 代 謝 物 に 対 す る 特 異 的 受 容 体 の 存 在 に ついて検討した。
ま ず 始 め に 、 ビ タ ミ ンD欠 乏 食 で 飼 育 し た ニ ワ ト り を 骨 折 さ せ 、 そ の 後 の 治 癒 に 対 す る 24R，25(OH)ユD3の 飼 料 添 加 効 果を 検討 し た。24R，25(OH)：D3は、 単 独で は低 い効 果 しか 示さ なか っ た が1a,25(OH)ZD3と 共 に 飼 料 に 添 加 す る と 骨 力 学 強 度 の バ ラ メ ー タ て （ ね じ り 強 度 、弾 性変 形限 界 角 、 硬 度 ） と 骨 灰 分 量 を 改 善 さ せ た 。 非 天 然 型 の 光 学 異 性 体 で あ る24S，25‑dibydroxyvitamin D3 [24S,25(OH)：Dユ］と1a，25(OH)2Dユの併用群、もしくはla，25(OH)ZD3の単独投与群では、24R，25(OH)：Dユ と1a，25(OH)2D3の併用に比 較して治療効果は低かった。
上 記 の 結 果 か ら 、 骨 折 治 癒 仮 骨 形 成 に 際 し て 、24R,25(OH)zDユ と24S，25(OH)：D3と は 識 別 さ れ る 可 能 性 が 示 さ れ た の で 、 次 に 骨 折 治 癒 仮 骨 に24R,25(OH)：Dヨ に対 する 特異 的 な受 容体 が存 在 す る か 否 か 検 索 し た 。 骨 折 治 癒 仮 骨 に お い て は 、 古 典 的 な核 内／ 可溶 性の24R，25(OH)：D3に 対す る 受容 体は 見出 せな か った 。一 方、24R，25(OH)：Dユに 対 する 特異 的な 受容 体 ／結 合夕 ンバク質が骨折治 癒 仮 骨 の 膜 画 分 に 見 出 さ れ 、 特 異 的な りガ ンド 結 合親 和性 を示 した 。 この24R,25(OH)2Dユ 受容 体の 、 解 離 定 数KDは18.3土1．9nM、 最 大 結 合 量B… は43.9土6.0 fmol/mg mg蛋 白 で あ り 、 親 和 性 の 指 標 であ るRelativc Competitive Index (RCI)は、24R,25(OH)2D3/24S,25(OH)̲D3/25(OH)D3/la，25(OH)ZD3の 各 ビ タ ミ ンD代 謝 物 に 対 し て100/37/42/1．8で あ っ た 。 こ のRCIバ タ ー ン は 、 ． 光 学 異性 体の 差異 を 識 別 し な い ニ ワ ト リ 血 清 中 の ビ タ ミ ンD結 合 夕 ン バ ク 質(DBP)のRCIバ タ ー ン(RCI＝
100/100/219/4，j） と は 異 な っ て い た 。 こ の 膜 に 存 在 す る24R，25(OH)zDユ 受 容 体fま24R，25(OH)2D3に 対 す る 特 異 性 がtt吾 い の で 、 光 学 異 性 体24R.25(OH)：Dユ と24S，25(OH)ユDユ と の 間 に あ る 僅 か な 構 造 上 の 差異を識別I，てい るものと考えられる 。
従/こ 、lq，25(OH)：Dユ に 対 す る 核IJ丶Jの 受 容 体 は 骨 芽 細 胞 株 にrf在 す る が 破 骨 細 胞 に は 存{F し な い こ と カ ゝt‖ ら れ て い る 。 し か し な がfゝ 、 骨 折 治 癒 過 程 に 形 成 さ れ る 仮 骨 組 織 で の 受 容 体 に つ い て は 系 統l'竃 検 索 は な さ れ て い な い 。 そ こ で 、 腓 骨 の 骨 折 治 癒 〃 く ，i j． 組 繊 の す べ て の 画 分 、E｜1ち
′ 骸 画 分 、 後 ｜ ち つ 膜 曲i分 、 及 び 超 遠 心 処Iil!憂 の可j姦性 画分 に つい て、l L,25(OH)2D3に 対 する 受容H、／
キ、，｜i合夕ンバ 冖1 1を検索した。 いずれのl11i ｝もl；｜；介活，H．を示したが、Iゑ画分に対する結合は高濃JIl のla，25(OH)：D， に お い て も 飽 和 状 態 を 示 さ な か っ た 。 し か し 、 仮 骨 の 膜 画 分 と 可 溶 性 画 分 に つ い て は 、 飽 和 状 態 を 示 す 結 合 が 見 出 さ れ 、KD/Bmax値 は そ れ そ れ0.83土0.35 nM/35．8土5.28 fmol/mg蛋 白 な ら び に0.66土0.38 nM/9.8土1.4 fmol/mg蛋 白 で あ っ た 。 こ れ ら の 受 容 塔 ‐ リ ガ ン ド の バ ラ メ 一夕ー値は 、24R，25(OH)ZD3￣受容体の値とは 明らかに異なってい た。
以 上 の 結 果 か ら 、 仮 骨 の 膜 画 分 に は24R．25(OH)：D， に 対 す る 受 容 体 ／ 結 合 タ ン バ ク 質 が 存 在 す る こ と 、 及 び こ の 受 容 体 はla，25(OH)：Dユ に 対 す る 受 容 体 やDBPと は 異 な る こ と が 明 ら か と な っ た 。 従 っ て 、24R,25(OH)エD3は1a，25(OH)：Dユ と は 異 な る 情 報 伝 達 の 経 路 を 介 し て 生 物 学 的 応 答 を 起 こ す 可 能 性 が 示 さ れ た こ と に な り 、 こ れ が 骨 折 治 癒 過 程 に お け る 本 ビ タ ミ ンD3代 謝 物 の 効 果 に 関 与 す る も の と 考 え ら れ る 。 以 上 本 研 究 の 結 果 か ら 、24R，25(OH)：Dは 仮 骨 形 成 に お い て 重 要 な ビ タ ミ ンDユ 代 謝 物 で あ り 、 膜 受 容 体 と の 相 互 作 用 に よ っ て 骨 折 治 癒 過 程 に そ の 機 能 を 発 現 し て い る こ と が 示 された。
学位 論文審 査の要旨
主 査 教 授 斉 藤 昌 之 副 査 教 授 中 里 幸 和 副 査 教 授 葉 原 芳 昭 副 査 助 教 授 木 村 和 弘
24R,25‑Dihydroxyvitamin D3 : a vitamin D3 metabolite essential for the healing process of a fracture and the evidence for its membrane receptor in fracture healing tissue
（ 骨 折 治 癒 に お け る ビ タ ミ ンD3代 謝 物24R25‑ジ ヒ ド ロ キ シ ビ タ ミ ン D3の 役 割 と そ の 受 容 体 に 関 す る 研 究 ）
ビ タ ミ ンDの 生 物 学 的 作 用 は 、 ビ タ ミ ンD3が 水 酸 化 反 応 を 受 け た 後 に 発 揮 さ れ る こ と が知 ら れ てい る 。1ロ ，25‑dihydroxyvitamin D3[1ば，25(OH)2D3]は代表的 な活性 型ビタミ ン D3代 謝 物 で あ り 、 こ れ に 対 応 す る 核 内 受 容 体 に つ い て も 広 く 研 究 さ れ て い る 。 一 方 、 24R，25‑dihydroxyvitamin D3[24R，25(OH)2D3]は、血 漿中に 高濃度で 存在す るにもか かわら ず 生 物 学 的 役 割 は ま だ 充 分 に は 解 明 さ れ て い な い 。 本 論 文 で は 、 骨 に お け る 24R，25(OH)2D3の 生 物 学 的 役割 に つ いて 、 ニ ワト り に おけ る 骨 折 治癒 の 実 験モ デ ル を用 い て 確 定 し 、 更 に こ の 代 謝 物 に 対 す る 特 異 的 受 容 体 の 存 在 に つ い て 検 討 し た 。 ま ず 始 め に 、 ピ タ ミ ンD欠 乏 食 で 飼 育 し た ニ ワ ト り を 骨 折 さ せ ェ そ の 後 の 治 癒 に 対 す る24R，25(OH)2D3の 飼 料 添 加効 果 を 検討 し た 。24R，25(OH)2D3は 、 単 独で は 低 い効 果 し か 示さ な か った が 、la，25(OH)2D3と 共に 飼 料 に添 加 す ると 骨 力 学強 度 の ノ ヾラ メ ー ター （ ね じ り 強 度 、 弾 性 変 形 限 界 角 、 硬 度 ） と 骨 灰 分 量 を 改 善 さ せ た 。 し か し 異 性 体 で あ る 24S，25(OH)2D3は無 効 で あっ た 。
こ れ ら の 結 果 か ら 、 骨 折 治 癒仮 骨 形 成に 際 し て、24R，25(OH)2D3と24S，25(OH)2D3とは 識別 さ れ る可 能 性 が示 さ れ た ので 、 次 に24R，25(OH)2D3に 対 する受 容体につ いて検 討した。
骨 折 治 癒 仮 骨 に お い て は 、24R，25(OH)2D3に 対す る 古 典的 な 核 内 ／可 溶 性 の受 容 体 は見 出 せ な か っ た が 、 膜 画 分 に 特 異 的 な 受 容 体 ／ 結 合 夕 ン パ ク 質 の 存 在 が 見 出 さ れ た 。 こ の 24R，25(OH)2D3受 容 体 の 解 離 定 数KDは18.3土1.9nM、 最大 結 合 量Bmaxは43.9土6.Ofmol/mg 蛋 白 で あ り 、 親 和'Iftの 指 標 で あ るrelative competitive indexは24R，25(OH)2D3／ 24S，25(OH)2D3／25(OH)D3／la，25(OH)2D3に 対 し て100／37／42／1.8で あ った 。 同 じ仮 骨 標品 に つ いて 、la，25(OH)2D3に 対 する 受 容 体／ 結 合 夕ン ノ ヾ ク質 を 検 索 した 所 、 膜画 分 と
