博士（農学） 遠藤圭太 学位論文題名

     博士（農学）   遠藤圭太 学位論文題名

樹木冬芽の越冬機構に関する研究

学位論文内容の要旨

  寒 冷 地 に 生 育 す る 多 く の 樹 木 の 冬 芽 は 氷 点 下 温 度 に 対 し て 器 官 外 凍 結 を 示 す 。 こ の 凍 結 挙 動 は 冬 芽 と い う 器 官 全 体 で 応 答 し 、 冬 芽 内 部 の 特 異 的 な 場 所 に 氷 晶 を 析 出 さ せ る も の で あ る 。 し か し 、 冬 芽 を 構 成 す る 様 々 な 組 織 に お い て 、 そ れ ぞ れ の 細 胞 の 凍 結 挙 動 を 明 ら か に し た 例 は な く 、 冬 芽 に 特 有 な 器 官 外 凍 結 機 構 の 詳 細 は 不 明 で あ っ た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 器 官 外 凍 結 す る カ ラ マ ツ(Larix kaemp fer7)冬 芽 の 凍 結 適 応 機 構 を 明 ら か に す る た め 、 冬 芽 な ら び に 冬 芽 か ら 摘 出 し た 各 組 織 を 用 い 、 そ れ ら の 細 胞 の 凍 結 挙 動 を 電 子 顕 微 鏡 法 に て 精 査 す る と 共 に 、 細 胞 内 の 水 の 凍 結 制 御 に 関 わ る 物 質 に つ い て 解 析 し た 。 ま た 、 ス ト ロ ー ブ マ ツ(Pinus strobus)、 カ ツ ラ （Cercば め ゑ 触 ｜ 皿 廊 や 弸 血Hm） 、 シ ラカ ン バ （ め ￠E出p幽tゆA班 ´a）の 冬 芽 に つ い て も 、 構 成 細 胞 の 凍 結 挙 動 を 電 子 顕 微 鏡 法 に よ っ て 解 析 し た 。

  カ ラ マ ツ 冬 芽 は 、 翌 春 の 成 長 を 担 う 枝 条 原 基 と 葉 原 基 を 中 心 に 、 原 基 の 基 部 に 位 置 す る ク ラ ウ ン や 原 基 を 覆 う 芽 鱗 な ど か ら 構 成 さ れ て い る 。 強 制 休 眠 期 の 厳 冬 期 （2月 ） に 採 取 し た カ ラ マ ツ 冬 芽 を 緩 や か な 冷 却 速 度 （5℃/day） で ．30℃ ま で 凍 結 し 、 低 温 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に よ っ て 凍 結 挙 動 を 観 察 し た と こ ろ 、 冬 芽 の 組 織 内 で は 細 胞 外 氷 晶 は 形 成 さ れ ず 、 ク ラ ウ ン 下 に あ る 空 隙 と 芽 鱗 の 間 の 細 胞 外 領 域 に 氷 晶 が 析 出 し 、 典 型 的 な 器 官 外 凍 結 を 示 し た 。 冬 芽 を 構 成 す る 細 胞 の 凍 結 挙 動 を さ ら に 分 析 し た と こ ろ 、 器 官 外 凍 結 中 で は 、 細 胞 外 氷 晶 に 隣 接 す る 比 較 的 厚 い 細 胞 壁 を 持 つ 芽 鱗 や ク ラ ウ ン の 細 胞 は 細 胞 外 凍 結 に よ っ て 脱 水 収 縮 し て い た が 、 細 胞 外 氷 晶 か ら 隔 離 さ れ る 薄 い 細 胞 壁 を 持 つ 枝 条 原 基 と 葉 原 基 の 細 胞 は 細 胞 内 水 分 の 一 部 が 脱 水 し た も の の 、 残 存 す る 水 は 細 胞 内 で 過 冷 却 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。   次 に 、 冬 芽 か ら 原 基 を 摘 出 し て 直 に 氷 に 触 れ る よ う に し て ‐5℃ ま で 凍 結 す る と 、 原 基 の 内 部 に 細 胞 外 氷 晶 が 析 出 し た 。 こ れ と 同 様 に 原 基 を ．10℃ ま で 凍 結 す る と 一 部 の 細 胞 が 細 胞 内 凍 結 し 、 さ ら に ‐30℃ ま で 凍 結 す る と 細 胞 内 凍 結 す る 細 胞 と 細 胞 外 凍 結 す る 細 胞 と が 混 在 し た 。 そ れ に 対 し て 原 基 下 部 に あ る ク ラ ウ ン 組 織 で は 全 て の 細 胞 が 細 胞 外 凍 結 し た 。 そ の た め 、 器 官 外 凍 結 す る カ ラ マ ツ 冬 芽 で は 、 原 基iま ク ラ ウ ン 組 織 や 芽 鱗 に 比 べ て 細 胞 の 脱 水 量 が 少 な く 細 胞 内 に 過 冷 却 水 が 残 存 し 、 原 基 細 胞 は 凍 結 傷 害 を 受 け や す い た め 、 器 官 外 凍 結 に よ っ て 原 基 か ら 細 胞 外 氷 晶 を 隔 離 す る も の と 考 え ら れ た 。

  ま た 、 自 発 休 眠 期 （n月 上 旬 ） の カ ラ マ ツ 冬 芽 か ら 摘 出 し た 原 基 の 凍 結 挙 動 も 調 べ た と こ ろ 、 強 制 休 眠 期 の 凍 結 挙 動 と は 異 な り 、 ‐15℃ の 凍 結 で ほ と ん ど の 細 胞 が 凍 結 脱 水 し て い た 。 さ ら に 、 強 制 休 眠 期 の 冬 芽 を ‐15℃ ま で 凍 結 す る と 、 細 胞 膜 脂 質 が 特 徴 的 な 相 分 離 を 起 こ し て い た 。 し か し 、 自 発 休 眠 期 の 原 基 細 胞 で は 細 胞 膜 脂 質 の 相 分 離 は 起 き て い な か っ た 。 こ の こ と か ら 、 自 発 休 眠 期 か ら 強 制 休 眠 期 へ 移 行 し た 過 程 で 原 基 細 胞 の 細 胞 膜 で 脂 質 組 成 が 変 化 し て 原 基 細 胞 の 凍 結 挙 動 に 影 響 を 与 え た こ と が 示 唆 さ れ た 。

  次 に 、 他 の 樹 種 の 冬 芽 の 凍 結 挙 動 を 調 べ る と 、 ．30℃ ま で 凍 結 し た 厳 冬 期 の カ ツ ラ 冬 芽 で は 芽 鱗 の 間 に の み 氷 晶 が 析 出 し 、 器 官 外 凍 結 を 示 し た 。 こ の 時 、 組 織 内 に 細 胞 外 氷 晶 の 析 出 は

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な く 、 薄 い 細 胞 壁 を 持 つ 花 原 基 や 葉 原 基 の 細 胞 は 部 分 的 に 脱 水 す る と と も に 過 冷 却 し 、 厚 い 細 胞 壁 を 持 つ 芽 鱗 の 細 胞 は 細 胞 外 凍 結 し た 。 ま た 、 冬 芽 か ら 摘 出 し た 花 原 基 を 氷 と 接 し た 状 態 で 凍 結 さ せ る と 組 織 内 に 細 胞 外 氷 晶 が 形 成 さ れ 、 ‐10℃ 以 下 ま で の 凍 結 に よ っ て お よ そ 50％ の 細 胞 が 細 胞 内 凍 結 し た 。 一 方 、 摘 出 し た 芽 鱗 の 細 胞 は 全 て 細 胞 外 凍 結 し た 。 そ れ に 対 し て 、 シ ラ カ ン バ の 冬 芽 は‑30℃ ま で 凍 結 し て も 器 官 外 凍 結 を 示 さ ず 、 花 原 基 や 葉 原 基 、 芽 鱗 の 組 織 内 に あ る 細 胞 間 隙 に 細 胞 外 氷 晶 が 析 出 し 、 全 て の 細 胞 が 細 胞 外 凍 結 し て い た 。 冬 芽 か ら 摘 出 し た 花 原 基 、 葉 原 基 お よ ぴ 芽 鱗 を‑30℃ ま で 凍 結 し て も 全 て の 組 織 の 細 胞 は 細 胞 外 凍 結 し た 。 ス ト ロ ー ブ マ ツ の 冬 芽 は 、 こ れ ま で の 冬 芽 と は 構 造 的 に 異 な り 芽 鱗 は 死 細 胞 に よ っ て 構 成 さ れ て い た 。 こ の 冬 芽 を‑30℃ ま で 凍 結 し て も 器 官 外 凍 結 を 示 さ ず 、 原 基 内 に 細 胞 外 氷 晶 が 形 成 さ れ 、 原 基 細 胞 は 細 胞 外 凍 結 を 示 し た 。 ま た 、 原 基 を 摘 出 し て 同 様 に 凍 結 し て も 細 胞 は 細 胞 外 凍 結 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 樹 種 ご と に 冬 芽 の 凍 結 挙 動 に 特 徴 が あ り 、 器 官 外 凍 結 も し く は 細 胞 外 凍 結 と い う 凍 結 適 応 機 構 の 違 い は 、 冬 芽 の 原 基 細 胞 の 細 胞 外 氷 晶 に 対 す る 感 受 性 の 違 い を 反 映 す る こ と が 考 え ら れ た 。

  さ ら に 、 器 官 外 凍 結 す る カ ラ マ ツ 冬 芽 に お い て 、 原 基 細 胞 が 部 分 脱 水 し な が ら も‑30℃ 以 下 ま で 過 冷 却 す る メ カ ニ ズ ム を 調 べ る た め 、 過 冷 却 に 関 与 す る 物 質 の 検 出 な ら び に 抽 出 を 試 み た 。 ま ず 、 カ ラ マ ツ 冬 芽 か ら 得 た メ タ ノ ー ル 粗 抽 出 物 を 含 む 水 溶 液 の 凍 結 温 度 を 測 定 し 、 市 販 の 蒸 留 水 （ 対 照 区 ） の 凍 結 温 度 と 比 較 す る こ と で 過 冷 却 活 性 を 調 べ た 。 冬 芽5g新 鮮 重 量 か ら 得 ら れ る 抽 出 物 の 含 量 を1 mlの 蒸 留 水 に 溶 解 し た 濃 度 に 調 製 し た 水 溶 液2ulを0.2℃ /minに て4℃ か ら‑60℃ ま で 冷 却 す る と 、 蒸 留 水(‑28.1℃ ） と メ タ ノ ー ル 粗 抽 出 物 を 含 む 水 溶 液(‑32.7℃ ） の 凍 結 温 度 の 差 の4.6℃ が 過 冷 却 活 性 と し て 検 出 さ れ た 。 そ こ で 、 過 冷 却 活 性 の 原 因 物 質 を 調 べ る た め 、 有 機 溶 媒 に 対 す る 溶 解 性 の 違 い に よ っ て メ タ ノ ー ル 粗 抽 出 物 を 順 次 分 画 し 、 酢 酸 エ チ ル 画 分 、 メ タ ノ ー ル 画 分 お よ び 残 渣 画 分 を 得 た 後 、 こ れ ら の 画 分 に つ い て 過 冷 却 活 性 を 評 価 し た 。 メ タ ノ ー ル 粗 抽 出 画 分 と 同 じ 濃 度 に 調 製 し て 活 性 を 測 定 し た と こ ろ 、 メ タ ノ ー ル 画 分 で の み6.4℃ の 過 冷 却 活 性 が 検 出 さ れ た 。 さ ら に 、 こ の 画 分 を 、 セ フ ァ デ ッ ク スLH‑20カ ラ ム に て 分 子 量 の 違 い に よ っ て3つ の 画 分 に 分 画 し た と こ ろ 、 画 分2 と3で そ れ ぞ れ5.5℃ 、3.2℃ の 過 冷 却 活 性 が 検 出 さ れ た 。 最 も 高 い 活 性 が 得 ら れ た 画 分2の 成 分 をHPLC等 で 調 べ た と こ ろ 、 主 成 分 と し て ピ ニ ト ー ル 、 フ ル ク ト ー ス 、 グ ル コ ー ス 、 ス ク ロ ー ス 、 メ リ ビ オ ー ス 、 ラ フ ィ ノ ー ス が 含 ま れ て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ の6種 類 の 化 合 物 に つ い て 、 セ フ ァ デ ッ ク ス 画 分2に 含 ま れ て い る 濃 度 と 等 し く な る よ う 市 販 の 試 薬 を 調 合 し て 混 合 溶 液 を 調 製 し た と こ ろ 、 過 冷 却 活 性 は2.4℃ で あ っ た 。 こ の 値 と セ フ ァ デ ッ ク ス 画 分2の 過 冷 却 活 性(5.5℃ ） と の 間 に 差 が あ る た め 、6種 類 の 主 成 分 以 外 の 物 質 が 過 冷 却 活 性 に 寄 与 す る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。

  本 研 究 に よ り 、 器 官 外 凍 結 し て い る カ ラ マ ツ 冬 芽 で は 、 ク ラ ウ ン 組 織 や 芽 鱗 の 細 胞 で は 細 胞 外 凍 結 し 、 原 基 細 胞 は 部 分 的 に 脱 水 し な が ら も 過 冷 却 す る こ と が 初 め て 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 原 基 か ら 脱 水 さ れ た 水 は 、 凍 結 感 受 性 の 高 い 原 基 内 に と ど ま ら な い よ う に 細 胞 外 氷 晶 に 対 す る 障 壁 と な る ク ラ ウ ン 組 織 や 芽 鱗 の 外 へ 氷 晶 と し て 析 出 さ せ て い る も の と 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、 糖 な ど の 炭 水 化 物 や 未 同 定 の 成 分 が 細 胞 内 に 蓄 積 し 、 さ ら に 部 分 脱 水 に よ っ て 溶 質 濃 度 が 高 ま る こ と に よ っ て 原 基 細 胞 内 の 水 が 過 冷 却 を 維 持 す る こ と に 貢 献 す る も の と 考 え ら れ た 。 冬 芽 の 器 官 外 凍 結 は 、 凍 結 感 受 性 の 高 い 原 基 細 胞 の 凍 結 傷 害 を 防 ぐ た め 、 冬 芽 全 体 で 水 の 凍 結 を 制 御 す る 非 常 に 特 徴 的 な 凍 結 適 応 機 構 と 結 論 づ け ら れ た 。

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学位論文審査の要旨 主査 副査

副査 副査

准 教 授    荒 教授   佐 客員教授   今 講師   福

川 圭 太 野 雄 三 井 亮 三 士 幸 治

学 位 論 文 題 名

樹木冬芽の越冬機構に関する研究

   本論文は、4 章からなり、図54 、表4 、引用文献113 編からなる総頁113 頁の和文論文で ある。この他に参考論文5 編が添えられている。

   寒冷地に生育する多くの樹木の冬芽は氷点下温度に対して器官外凍結を示す。器官外 凍結は、冬芽を構成する各組織が協調して冬芽内部の特異的な空隙に氷晶を析出させる ものであるが、その詳細な仕組みは不明であった。そこで本研究では、器官外凍結する カラマツ(Larix kaempferi) 冬芽を主たる材料に用い、冬芽を構成する組織や細胞の凍 結挙動を電子顕微鏡法にて精査すると共に、細胞内の水の凍結制御に関わる物質の存在 の有無を検証し、冬芽の凍結適応機構について解析した。

   カラマツ冬芽は、枝条原基や葉原基を中心に、原基の基部に位置するクラウン組織や 原基を覆う芽鱗などから構成されている。強制休眠期の厳冬期（2 月）に採取したカラ マツ冬芽は緩やかな冷却速度（5 ℃/day) で―30 ℃まで凍結しても生存率は低下しなかっ た。この時の冬芽の凍結挙動を低温走査型電子顕微鏡(cryo‑SEM) で観察すると、芽 鱗の間やクラウン組織下の空隙のみに氷晶がみられ、原基などの組織内部では細胞外氷 晶は検出されなかった。氷晶に隣接する芽鱗やクラウン組織の細胞では細胞外凍結によ って脱水収縮し、原基細胞では細胞内の水が一部脱水したが残存する水は過冷却してい た。冬芽から摘出した原基を直に氷に触れさせて−30 ℃まで凍結すると、細胞内凍結や 細胞外凍結によって生存率は20 ％まで低下した。カラマツ冬芽では、部分脱水すると共 に深過冷却する原基は凍結傷害を受けやすいため、細胞外凍結する芽鱗聞やクラウン組 織下の空隙にて脱水された水を細胞外氷晶として析出することで原基を氷から隔離す るものと考えられた。

   また、この冬芽（強制休眠期）を−15 ℃まで凍結すると、原基細胞の細胞膜脂質は特 徴的な相分離を起こしたが、自発休眠期（11 月上旬）の原基細胞では細胞膜脂質の相 分離は起きなかった。したがって、自発休眠期から強制休眠期ヘ移行すると、厳しい寒 さ の 中 で も す で に 原 基 細 胞 に 生 理 的 変 化 が 生 じ て い た こ と が 判 明 し た 。    次に、他の樹種で冬芽の凍結挙動を調べると、厳冬期のカツラ（Cercidiphyllum

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japonicum） 冬 芽 は カ ラ マ ツ と 同 様 に 器 官 外 凍 結 し 、 原 基 細 胞 は 部 分 脱 水 す る と 共 に 深 過 冷 却 し 、 芽 鱗 の 細 胞 は 細 胞 外 凍 結 し て い た 。 一 方 、 シ ラ カ ン バ(Betula platyphylla) や ス ト ロ ー ブ マ ツ(Pinus strobus)の 冬 芽 は 組 織 内 の 細 胞 間 に 細 胞 外 氷 晶 が 析 出 し 、 原 基 を 含 む 全 て の 細 胞 は 細 胞 外 凍 結 を 示 し た 。

  さ ら に 、 器 官 外 凍 結 す る カ ラ マ ツ 冬 芽 に お い て 、 原 基 細 胞 が 部 分 脱 水 し な が ら も‑30℃ 以 下 ま で 深 過 冷 却 す る 分 子 機 構 を 調 べ る た め 、 過 冷 却 に 関 与 す る 物 質 の 検 出 及 び 抽 出 を 試 み た 。 カ ラ マ ツ 冬 芽5g新 鮮 重 量 か ら 得 ら れ る 抽 出 物 を1mlの 蒸 留 水 に 溶 解 し た 濃 度 に 相 当 す る よ う 調 製 し た 試 料2ulを0.2℃/minに て4℃ か ら −60℃ ま で 冷 却 す る と 、 蒸 留 水 よ り も 試 料 の 凍 結 温 度 が4.6℃ 低 下 し た こ と で 過 冷 却 活 性 が 検 出 さ れ た 。 そ こ で 、 こ の 過 冷 却 活 性 の 原 因 物 質 を 見 出 す た め 、 有 機 溶 媒 に 対 す る 溶 解 度 の 違 い に よ っ て メ タ ノ ー ル 粗 抽 出 物 を 順 次 分 画 し た と こ ろ 、 メ タ ノ ー ル 画 分 に 過 冷 却 活 性 を 検 出 し た 。 こ れ を セ フ ァ デ ッ ク スLH‑20カ ラ ム で3っ に 分 画 し た と こ ろ 、 画 分2と3で そ れ ぞ れ5.5℃ 、 3.2℃ の 過 冷 却 活 性 が 検 出 さ れ た 。 こ の 画 分2の 主 成 分 を 分 析 し た 結 果 、 ピ ニ ト ー ル 、 フ ル ′ ク ト ー ス 、 グ ′ レ コ ー ス 、 ス ク ロ ー ス 、 メ リ ビ オ ー ス 、 ラ フ ィ ノ ー ス が 含 ま れ て い る こ と が 判 明 し た 。 こ の6種 類 の 化 合 物 を セ フ ァ デ ッ ク ス 画 分2の 濃 度 と 等 し く な る よ う 市 販 の 試 薬 を 用 い て 混 合 溶 液 を 調 製 す る と2．4℃ の 過 冷 却 活 性 を 示 し た が 、 分 画 前 の 過 冷 却 活 性(5.5℃ ） よ り 低 下 し た た め 、6種 類 の 主 成 分 以 外 の 物 質 が 過 冷 却 活 性 に 寄 与 す る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。

  本 研 究 で は 、 冬 芽 の 凍 結 適 応 機 構 が 樹 種 に よ っ て 異 な る こ と が 明 ら か に な り 、 器 官 外 凍 結 も し く は 細 胞 外 凍 結 と い う 冬 芽 の 凍 結 挙 動 の 違 い は 原 基 細 胞 の 凍 結 感 受 性 を 反 映 す る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 ま た 、 カ ラ マ ツ 冬 芽 の 器 官 外 凍 結 は 、 凍 結 挙 動 や 凍 結 抵 抗 性 の 異 な る 組 織 が 協 調 し て 水 の 凍 結 を 制 御 す る こ と で 凍 結 感 受 性 の 高 い 原 基 細 胞 の 凍 結 傷 害 を 防 ぐ と い う 凍 結 適 応 機 構 で あ る と 結 論 づ け ら れ た 。 こ れ ら の 研 究 成 果 は 独 創 性 が あ り 、 樹 木 冬 芽 の 越 冬 機 構 に 関 す る 基 礎 的 知 見 を 提 供 す る も の と し て 学 術 上 高 く 評 価 さ れ る 。

  よ っ て 、 審 査 員 一 同 は 、 遠 藤 圭 太 が 博 士 （ 農 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 認 め た 。

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