博 士 （ 医 学 ） 荒 瀬 規 子
学 位 論 文 題 名
骨 髄 移 植 キ メ ラ マ ウ ス を 用 い た ， 胸 腺 内 自己 反 応 性 T 細 胞 ク ロ ー ン 消 去 機 構 の 解 析
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
I研 究 目的
骨髄 移 植 は 自 血病 そ の 他 の 病気 の 治 療法 として 、重要 性が 増して いる。 一方、 その 際の重 大 な 副 作用 で あ るGVHR（ 移 植 片対 宿 主 反 応 ）が 臨 床 上 問 題と な っ て い る。 本 研 究 で は、 骨髄移 植 マ ウス （ 骨 髄 キメ ラマウ ス） を用い て、1．ド ナ一骨 髄より 分化 する胸 腺細胞 の宿主 に対す る 寛 容 獲得 機 序 、2.GVHRによ る 胸 腺 内 寛容 誘 導 の 障 害 、に つ い て 検 討し た 。 骨 髄 キメ ラマ ウス の 胸 腺細 胞 分 化 は 、胎 生 期 の 様 式 と類 似 すると 考えら れてい るの で、本 研究の 結果は 、生理 的 な 自 己寛 容 誘 導 、 維持 メ カ ニ ズ ム にも 応 用 で き る。 ま た 、GVHRに 関 して は 、 ヒ ト 骨髄 移植後 の 慢 性GVHRの機 序 の 解 明 の 基礎 デ ー タ と なり 得 る と 考 えら れ る 。
H 実験材料と方法
実 験デ ザ イ ン は 、ま ず マ イ ナ ー組 織 適 合 抗 原 のー つMls‑l抗 原 が異 なるマ ウス間 で骨 髄キメ ラ を 作 成後 （ 多 く はBlo H‑2コ ン ジ ェ ニッ ク マ ウ ス(Mls̲lb，vp6゛，Thyl.2)を ドナー 、AKRマ ウス(Mls‑l￣，I‑E十，vp6‑，Thyl.l)をレシピェントとした）、Mls‑l゜抗原とH‑2クラスII (I‑E，IーA） 分 子 を 同 時 に 認 識 す るvp6T細 胞レ セ プ タ ー(TCR)を 発現 す る 胸 腺 細胞 の 頻 度 を フロ ー サ イ ト メー ター で解析 した。V閃 ＋T細胞は、Mls‑l゜かつI‑E十の細胞に反応するため、Mls‑l ，IーE＋の マ ウ ス では 、 消 去 さ れ 自己 寛 容 に な るこ と が判 明し ている 。また 、同様 の系で 、ヒ ト骨髄 移植
と 同 様 、 骨髄 移 植 時 少数 の 成 熟T細胞 を混入 し、胸 腺細胞分 化への 影響を 解析し た。
1．骨髄 移植： 致死量(1000 rad)X線照射したAKRに、ドナーBl0系マウスの骨髄細胞（2
−3X 107個）を移植した。キメラは［ドナー→レシピェント］と表す。骨髄細胞は抗Thy‑1.2 抗 体と補 体で処 理し、 成熟T細 胞を除 去した （実験によってはCONTROLキメラと表す）。
軽 度のGVHRを生じ させる時は、骨髄細胞と同時にナイロンウールカラムにより精製したl X l05個の脾臓T細胞を移植した(GVHRキメラと表わす）。
2，細胞表 面抗原 の解析 ：骨髄 移植後1週また は5ー7週のキメラマウスより、胸腺細胞浮 遊液を作成し、抗Thy‑l抗体または抗TくニR（抗CD3，vp8，vp6)抗体、biotinー抗マウス・
ラ ッ トIgG抗 体，Duochrome、さら にPEー抗CD4，FITCー抗CD8抗体 にて染 色後、CD4+8‑
またはCD4ー8＋細胞上の抗原をFACS解析した。vp6十T細胞上のクラスI発現は、抗Kk，Kb， Dd抗体と抗vp6抗体による二重染色により解析した。
3．免疫組織染色：骨髄キメラマウスの胸腺の凍結切片を作製後、抗vp6抗体、biotinー抗 ラットIg抗体、ABCキット、DABにて染色した。
m 結 果
1． 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス に お け る 自 己 反 応 性vp6゛ 胸 腺 細 胞 消 去 の メ カ ニ ズ ム
CD4十8― 及 ぴCD4―8十 胸 腺 細 胞 中 のV閃 十 細 胞 の 頻 度 は 、 ド ナ ー がI‐E゛ のBlO.BR，BlO.AQR (AQR)，B10.D2、 レ シ ピ ェ ン ト がAKRの 時 、 そ れ ぞ れ0.6士0.2%，0.9士0.2ゲ 。 ，2.0士0.29fと 、 正 常 ド ナ ー マ ウ ス の6‑10％ と 比 較 し て ほ ぼ 完 全 に 消 去 さ れ て い た 。 一 方 、 ド ナ ― がI‑E― のB 10.G (I‑Aq） ，Bl0 (I̲Ab） ，BlO.A (4R) (I̲Ak） で は 、 そ れ ぞ れ6.9士0.8ゲ 。 ，4.3士0.5ゲ 。．2.9土0.1ワ。
とvp6゛ 細 胞 が 消 去 さ れ な い か 、 消 去 程 度 が 小 さ か っ た 。 こ れ らvp6＋ 細 胞 の 頻 度 は 、 以 後 終 生 変 化 し な か っ た 。 宿 主 及 ぴ 胸 腺 上 皮 細 胞 が 同 一 条 件 で も 、 ド ナ ー がI‑E゛ の 時 の み 完 全 にvp 6゛ 細 胞 が 消 去 さ れ た こ と か ら 、 自 己 反 応 性 ク ロ ― ン 消 去 に は 骨 髄 由 来I‑E゛ 細 胞 が 重 要 で あ る こ と が 証 明 さ れ た 。 ま た 、I‑E一 ド ナ ー に お ぃ て も 、I‑Aの 型 に よ りvp6十 細 胞 の 割 合 が 変 化 し た こ と か ら 、 宿 主 由 来 のMls‑l． 抗 原 と ド ナ ー の ク ラ スH抗 原 のaffinityに よ り 、V[36十 細 胞 の 消 去 の 程 度 が 決 定 さ れ る こ と が 判 明 し た 。
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骨 髄 由 来 細 胞がvp6+細胞 の 消 去 に 重要 で あ る こ とを さ ら に 明 らか に す る た め 、Bl0とAKR の 骨 髄を 混 合 し てBl0に 移 植し 、5週 後 にBl0由来の 胸腺細 胞(Thy‑1.2゛）中 のvp6゛細胞 の頻 度 を 見た と こ ろ 、 ほぼ 完 全 に 消 去さ れ て い た 。
以 上 よ り 、 骨髄 由 来 細 胞 の みで 、 胸 腺 細 胞のク ローン 消去が 達成 される ことが 明らか とな っ た 。
2． 骨髄 移植後1週 にGVHRキメ ラマ ウスの 胸腺内 で生じ た急 性GVHR
GVHRが 胸 腺 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ る た め に 、T細 胞 と 骨 髄 を 移 植 し たGVHRキ メ ラ[AQR +AKRJと 、 骨 髄 の み 移 植 し たCONTROLキ メ ラ で 胸 腺 のT細 胞 のThy‑｜ ア ロ タ イ プ 、 及 びT CR頻度 を調べ た。 移植後1週 にGVHRキメ ラの 胸腺に は、ド ナー由 来ロhy‐1．2十 ）のCD4十8−，
CD4−8十 細胞が増加していた（それぞれ46．7ゲ。，47．1％）。これら成熟型胸腺細胞は、a沁nROL キ メ ラで は 全 く 見 られ な か っ た こと か ら 、 移 植 時混 入 し た 成 熟T細 胞 と 考 えら れ た 。 さらに このG丶 弧キメ ラのCD4十8−，CD4−8十 細胞のTCRを 解析し たと ころ、 ドナー 型V邸十細 胞が有意 に増 加していた（56．5％，43．1ゲ。）。これらのVp6十T細胞は大型のプラスト様細胞で、宿主のM b．1． 抗 原 に 反 応し て増加 した と考え られた 。組織 学的に も胸 腺実質 内にV閃゛T細 胞の増 加が 確認 された 。
以 上 よ り 、 骨 髄移 植 時T細 胞を 少 数 混 入 させ た 骨 髄 キ メラ マ ウ ス に おい て は 、 移 植 後初期 に 胸 腺 内 で 宿 主 抗 原 （Ml．lI） に 対 す る 急 性G丶 彊 永 が 生 じ る こ と が 判 明 し た 。
3． GVHRキ メ ラマ ウ ス に お けるvp6+T細 胞 消 去 機 構の 破 綻
次 に 、 移 植 後 早 期 の 胸 腺 内GVHRのT細 胞 分 化 に 与 え る 影響 を 調 べ る ため に 、 移 植 後5週 のCONTROLとGVHR [AQR→ AKR]キ メ ラ マ ウ ス の 胸 腺 を 解 析 し た 。 前 に も 示し た よ う にC ONIROLキ メ ラ で はVp6゛ 細 胞 は 消 去 さ れ て い た が 、GVHRキ メ ラで はAQRド ナ ー マ ウ ス とほ ぼ 同頻 度のvp6＋ 細胞が 出現し た(CD4十8一 細胞で8.6士0.3%，CD4−8十細 胞で1414士0.99ro)。 こ れ ら の 自己 反 応 性T細胞 は5週 以 降も 同 じ 頻 度 で 存在 し た 。
こ れ ら のvp6+細 胞 が 骨 髄 か ら 分化 し た 細 胞 であ る こ と を 明 らか に す る た め、GVHR [AQR
+AKR]で骨髄移植時(BlOX AQR) FiのT細胞を加える実験を行っ た。移植後1週に胸腺内で 増殖したV[36゛細胞はF・T細胞由来、移植後5週に出現したVI36゛細胞はAQR骨髄由来のクラ スI発現バターンを示した。
以上 より、移植後初期の胸腺内GVHRの影響で、胸腺細胞分化の際、自己反応性vp6+T細 胞消去機構が障害されることが判明した。
IV 考 察
本研究では まず、骨髄由来クラスu陽性細胞（おそらくマクロファージ、樹状細胞）が、
胸腺内の自己反応性クローン消去に重要であることを示した。さらに、胸腺が骨髄移植後初 期のGVHRの標 的臓器となり、その結果自己 反応性クローン消去機構が障害されることを初 めて明らかに した。本研究ではT細胞の標的抗原となる自己抗原成分は、マウス固有のスー バー抗原、Mls‑l．（マウス内在性ウイルス遺伝子産物）だが、ヒト骨髄移植の際もヒトの自 己抗原に対し て同様な寛容機構の障害が生じ得ると考えられる。ヒトでは、骨髄移植後3カ 月 以降 に発 症する慢性GVHRとい う病態が報告されている。 慢性GVHRは急性GVHR後に発症 することが多く自己免疫病様の病態を示す場合があることから、本研究で示した胸腺内急性 GVHRの結果、 骨髄前駆細胞より新たに産生 された自己反応性T細胞が、 この病態に関与す る可能性が考えられた。
V 結 語
Blo H‑2コンジェニックマウス(Mls̲lb）とAKR (Mls‑l＾）間で種々の骨髄キメラマウスを作成 し、胸腺 内クロ―ン消去(Vp6゛T細胞 ）に骨髄由来クラスH陽性細胞が重要な役割を果たす ことを示 した。また、この自己寛容誘 導機構がGVHRにより障害さ れることが判明した。
以上よ り、ヒト骨髄移植後の急性GVHRによる胸腺機能障害が、 慢性GVHRや移植片対自 血病(GVL)反応等に関与する可能性が推察された。
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