博士（歯学） 田仲宏光 学位論文題名
ラット脳カルシウム依存ATPase 活性の静脈麻酔薬による 抑制
学位論文内容の要旨
緒言
静脈 麻酔 薬を 含む 全 身麻 酔薬 の作 用機 序に関する研究は、生体膜脂質に 対する作用 を 重視 する りピ ド説 と 、特 定の 機能 性タ ンパタ質に対する作用を重視する タンパク説 に大きく分けられるが、そのメカニズムは確定していない。本研究では、Ca，Mg‑*‑ATPase 活 性に 対す るpropofolの作用と、他の静脈麻酔 薬としてpentobarbitalとthiopentalの 作用を調べ た。
材料と方法
1．ラット脳からのCa―ATPase及びCa，Mg―ATPaseの部分精製
ラッ ト全 脳の ホモ ジ ェネ ート を調 整し 膜分画の部分精製を行った。ラッ ト全脳から 得たホモジ ェネートを二回の遠心を行って得られた沈渣を膜分画と した（PI）。また、
同 様に して 得ら れた ホ モジ ェネ ート を、Pottorfの方法に従って形質膜（PII）及ぴミ クロソーム(Pm）分画に部分精製した。
2．ATPase活性の測定
Ca−ATPase活 性及ぴCa，Mg―ATPase活性は、ATP加水分解の結果生成され た無機リン 量をChifflet法に従って分光光度計を用い850nmで測定した。
3． ウ エ ス タ ンブ ロッ ティ ング によ るPMCA (plasma membrane Ca→ATPase)の 検出 発現 タン パク 質の解析のため、通法に従い電 気泳動を行った。1次抗体と してウサギ 由 来の 抗PMCA1〜3及 ぴ マウ ス由 来の 抗PMCA4抗 体を、2次抗体としてPMCA1〜3にはヤギ 由来抗ウサ ギIg一HRPを、PMCA4にはウサギ由来抗マウスIgl−HRPを 用いた。ウエスタン プ ロ ッ テ ィ ン グは 、SDS‑PAGEゲ ル 中の タン パク 質をPVDF膜に 転写 する こと によ って 行った。ペ ルオキシダーゼ反応はWestern Lighting PltrsーECLを用い、発光をフィルム への感光に よって検出した。
結果
1．ラット脳膜分画Ca−ATPaseに対するpropofolの作用
Ca‐ATPase活 性は 、Ca濃 度に 依存 して 増加 し1mMでほ ば飽 和し た。Ca―ATPase活性 に 対 す るpropofolの影 響を 調べ と ころ 、濃 度に 依存 してCa−ATPase活 性を 阻害 した
‑ 509―
が 、 1.03 mMで も 完 全 に は 阻 害 せ ず 、 30%以 上 活 性 が 残 存 し た 。 種 々 濃 度 のpropofol存 在 下 で のCa‑ATPase活 性 のCa濃 度 依 存 性 を 調 ベ 、 Lineweaver→Burkの二重逆数プロットを行った。Vmaxは、propofol濃度が上昇するに っれて低下した。Kmはpropofol濃度0，4mMまではほば一定であったが、それ以上の 濃度では低下した。
2． 形 質 膜 分 画 と ミ ク ロ ソ ー ム 分 画 のCaで 活 性 化 さ れ るATPase活 性 の 相 違 Pottorfの方法に従ってPIIとPmの分画を得て、ウエスタンブロッティングを行つ たとこ ろ、いず れもPMCAのア イソザイ ムであるl〜4を含むことを確認した。次に 2 mM Mg存在下 でのATPase活性 のCa濃度依存性を調べたところPII、PmともCaの濃 度に依存して活性は増加し、100 )uMで最大となった。PII、PIIIともPMCA阻害剤であ るvanadate韜よぴSERCA（sarcoendoplasmic reticulum Ca―ATP．ase）阻害剤である thapsigarginの濃度に依存して活性は抑制された。PII、PmのCa，Mg―ATPase活性のpH 依 存 性 を 調 べ た と こ ろ 両 活 性 と も 中 性 pHで 最 大 活 性 を 示 し た 。 3．ラット脳Ca，MgーATPase活性に対する静脈麻酔薬の作用．
Propofolは低濃度でPIIの活性をわずかに増加させたが、高濃度では抑制に転じた。
Pmはpropofol濃度 に依存し て活性が 低下した。PII、Pmとも1,05 mMでは完全に活 性を抑 制した。Pentobarbitalとthiopentalはいずれも濃度に依存してPII、Pmの Ca，Mg−ATPase活性を抑制した。
考察
1． ラット脳Ca−ATPase活性のpropofolによる阻害様式
Propofolは濃度に依存してPIのCa−ATPase活性を阻害したが、1.03 mMでも完全 には阻害せず、3096以上活性が残存した。この結果はこのCa一ATPaseが均一では無いこ とを示唆する。種々濃度のpropofol存在下でCa−ATPase活性のCa濃度依存性を調べ たところ、Vmaxはpropofol濃度に依存して低下し，Kmも高濃度のpropofolで減少し た。長谷らはpropofolは混合阻害の様式でNa，K一ATPase活性を抑制すると結諭し、50％ 阻害濃度は0．26 mMであり今回のCa−ATPaseの場合に類似していた。これらの結果は propofolは膜分 画に存在 するATPaseを類似した様式で阻害することを示唆する。
2．ラット脳のCa，Mg一ATPase活性の静脈麻酔薬によ、る阻害
ウエスタンブロッティングによりいずれもPMCAの1〜4のアイソザイムを含んでい た。また、ATPase活性のCa濃度依存性とpH依存性はCa，Mg―ATPaseの特徴を示した。
さらに、vanadateとthapsigar ginによって阻害されたことは，PnとPmlまいずれも
PIIとPIIIのCa，Mg‑ATPase活性 に対 するpropofol、pentobarbital、thiopentalの 作用を調べたところ：いずれの麻酔薬も 濃度に依存してCa，Mg‑ATPase活性を抑制した。
50％ 阻害濃度は、Na，K‑ATPa:seに対する50％阻害濃度と 類似していた。これらの結果 は，propofol、pentobarbital及 ぴthiopentalは， 類 似し た機構でCa，MgーATPase及 ぴNa，K―ATPas;e活性を抑制することを 示唆する。
3，臨床的なpropofol濃度との比較
臨床 的に 麻酔 状態 を得 るた めに 必要 なpropofol濃 度 はヒ ト血 清で8〜180pMと様 々 な報 告が ある 。こ れら の 濃度 ではATPase活性を完全に阻 害するにはいたらなぃことか ら、ATPaseは 全身 麻酔 薬 の作 用には関係しないと評価さ れることが多い。しかし，薬 物の 作用 が起 こる 用量 で 作用 点となるタンパク質の機能 が完全に抑制される必要は無 いと 考え られ 、propofolによ るCa，Mg‑ATPase活性 の 阻害 が麻酔作用に関与する可能 性があると考えられる。
結諭
Propofol、pentobarbital及ぴthiopentalはNa，K一ATPase活性阻害と類似した濃度 と様式でCa―ATPase活性及ぴCa，Mg―ATPase活性を阻害したことから，これらの麻酔薬 の直 接の 作用 点は 生体 膜 であ り，その作用の結果として 膜たんぱく質の機能に影響を 与えたものと推測した。
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学位論文審査の要旨 主査 特任教授 福島和昭 副 査 教 授 鈴 木 邦 明 副 査 教 授 舩 橋 誠
学 位 論 文 題 名
ラ ット 脳カ ルシ ウム 依存 ATPase 活性 の静脈麻酔 薬による 抑制
審査 は審 査担 当者 が一 同に 会し て約1時間 半か けて 行っ た。 まず申 請者 に本 論 文の 概要 の説 明を 求め 、口 頭試 問形式 で提 出論文の内容及ぴ関連分野につい て 試 問 し た 。 申 請 者 は 論 文 の 概 要 を 以 下 の よ う に 説 明 し た 。
【緒 言】 静脈 麻酔 薬を 含む 全身 麻酔 薬の 作用 機序 に関す る研究は、生体膜脂質 に対 する 作用 を重 視す るり ピド 説と 、特 定の 機能 性タン パク質に対する作用を 重視するタンパク説に大きく分けられるが、．そのメカニズムは確定していなぃ。
本研 究で は、Ca，Mg ATPase活性に対するpropofolの作用と、他の静脈麻酔薬と してpentobarbitalとthiopentalの作用を調べた。
【材 料と 方法 】ラ ット 全脳 のホ モジ ェネ ート を調 整し膜 分画の部分精製を行っ た。 ラッ ト全 脳か ら得 たホ モジ ェネ ート を二 回の 遠心を 行って得られた沈渣を 膜分画とした(PI）。．また、同様にして得られたホモジェネートを、Pottorfの 方 法 に 従 っ て 形 質 膜(Pll） 及 び ミ ク ロ ソ ー ム(Pni)分 画 に 部 分 精 製 し た 。 Ca一ATPase活 性及 びCa，Mg‑ATPase活 性は 、ATP加 水分解 の結果生成された無機 リ ン 量 をChifflet法に 従っ て分 光光 度計 を用い850 nniで測 定し た。 ウエス タ ンブ ロッ ティ ング によ るPMCAの 解析 は、 通法 に従 い電気 泳動を行った。ペルオ キ シ ダ ー ゼ反 応はWestern Lighting Plus‑ECLを用 い、 発光 をフ イル ムヘの 感 光によって検出した。
【結果・考察】
Propofolは 濃度 に依 存し てPIのCa−ATPaseを 阻害 した が、1．03mMでも完 全 には 阻害 せず 、30％以 上活 性が 残存 した 。こ の結 果はこ のCa瑚Paseが均一では
ウ エ ス タ ン ブ ロッ ティ ング によ りPIIとP:aiは いず れもPMCAの1〜4の アイ ソ ザ イ ム を 含 ん で い た 。 ま た 、ATPase活 性 のCa濃 度 依 存 性 とpH依 存 性 は Ca，Mg‑ATPaseの 特 徴 を示 した 。さ らに 、vanadateとthapsigarginに よっ て阻 害さ れた こと から ，PIIとP皿は いず れもPMCAとSERCAの混合であることを示す。
一 方 、Mg‑ATPase活 性 のpH依 存 性 はPnとPlllで 異 な っ た こ と か ら 、PlIとPm は性質の異なる分画であると考えた。
PIIとPmのCa，Mg−ATPase活性に対するpropofol、pentobarbital、thiopental の作用を調べたところ、いずれの麻酔薬も濃度に依存してCa，Mg−・ATPase活性を 抑 制 し た 。Propofolは 低濃 度でPIIの活 性を わずか に増 加さ せた が、 高濃 度で は抑 制に 転じ た。PlaIはpropofol濃 度に依 存し て活 性が 低下 した 。PII、Pmcと も1.05 mMで は 完 全 に 活 性 を 抑 制 し た 。Pentobarbitalとthiopentalはい ずれ も濃 度に 依存してPII、PmcのCa，Mg−ATPase活性を抑制した。50％阻害濃度は、
Na，KIATPaseに対する50％阻害濃度と類似していた。これらの結果は，propofol、 pentobarbita1及 びthiopentalは ， 類 似 し た 機 構 でCa，Mg−ATPase及 び Na，K一ATPase活性を抑制することを示唆する。
臨 床 的 に 麻 酔 状 態を 得る ため に必 要なpropof01濃度 はヒ ト血 清で8〜180ロM と様 々な 報告 があ る。 これ らの 濃度 ではATPase活性 を完 全に 阻害 するにはいた らな ぃこ とか ら、ATPaseは 全身 麻酔 薬の作 用に は関 係し ない と評 価されること が多 い。 しか し， 薬物 の作 用が 起こ る用量 で作 用点 とな るタ ンパ ク質の機能が 完全 に抑 制される必要は無いと考えられ、propof01によるCa，Mg一ATPase活性の 阻害が麻酔作用に関与する可能性はあると考えられる。
各 審 査 委 員 が 行 っ た 主 な 質 問 は 、 以 下 の 通 り で あ る 。 1）GABAA受 容 体 の 働 き と そ の 機 序 につ い て
2） 生 体内 で のCa濃 度 と 今 回 の実 験で のCa濃度と の違 いに つい て 3）Ca, Mg―ATPaseの 阻 害 剤 に つ い て
4）propofolの 代 謝 に つ い て
5）Ca，Mg‑ATPaseの 阻 害 が 麻 酔 状 態 に 与 え る 影 響 に つ い て 6） 本 研究 の 今 後 の 方 向 性 に つ い て ．
これ らの 質問 に対 して 、論 文申 請者から明快な回答と説明が得られ、さらに 今 後 の 研 究 の 発 展 性 に つ い て も 明 確 な 計 画 を 持 っ て い る と 判 定 し た 。 審査 委員 は全 員、 本研 究が 学位 論文として十分値し、申請者が博士（歯学）
の 学位 を授 与さ れる 資格 を有 する もの と認 めた。
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