博士（医学）後藤田敏彦 学位論文題名
I ー E 拘束性ハトチトクロー厶 c 断片類似抗原特異的 T 細胞反応におけるアグレトープモチーフの検索
学位論文内容の要旨
ヘ ル パ 一T細 胞 の 活 性 化 は ， 主 要組 織 適 合 遺 伝 子複 合 体 （MHC)に コ ード さ れ る ク ラスn分 子，T細 胞 抗 原レ セ プ タ 一 （TCR)，抗 原 分 子 に よる三 分子複 合体 が形成 される ことに より誘 導 ざれ る 。 こ の 際抗 原 分 子 上 で，TCRと 結合 す る 部 分 をエ ピ 卜 ― プ ，ク ラスH分 子と結 合する 部 分を アグレ トー プと呼 ぷ。特 定の抗 原分子 に対 するT細胞 反応性 の欠落 を規定 する 因子と して，
その 抗原に 対応 するT細胞 レパー トリー が欠損 してい る場 合と， クラス 矼分子 と抗 原との 結合が 起こら ず抗原 提示が 行なわ れな い場合が考えられるが，後者が遙に多いと言われている。従って，
各クラ スII分子 に適 合した アグレ トープ モチー フの 検索は ，種々 の自己 免疫疾患の原因特定や，
合成ワ クチン 作成に 重要で ある 。
本 研 究 では ， ハ ト チ トク 口ー厶c類 似ペプ チド，p43ー58アナ 口グ， に特異 性を 示し， マウス MHCク ラ スuの ー つ ，I一E分 子 に 拘 束 さ れ るT細 胞 反 応 を 解 析 す る こ と に よ り ，p 43ー58 の機能 部位を 明らか にした 。ま た，こ の際の アグレ 卜ー プモチ ーフに 関し， 多くのマウス系統に っ い て 検 討 ， 比 較 し ， 各IーE分 子 に 親和 性 の 強 い モチ ー フ を 決 定す る こ と を 目的 と し た 。
材 料 と 方 法 マ ウ ス
C57BL/10（ 以 下B10)，B10.A（3R） （ 以 下3R） ，Bl0.A（4R） （ 以 下4R） ，Bl0 BR（ 以 下 BR)， Bl0． PL（ 以 下 PL） ， B10. SM（ 以 下 SM)を 使 用 し た 。 ペ プ チ ド 抗 原
自 動 ペ プチ ド 合 成 機 によ り ，T一Boc法 に よ り作 成 し た 。 命名 は ，p43一58を基準 として ， 置 換 部 位 と 置 換後 の ア ミ ノ 酸の1文 字 表 記名 で 表 わした （例： 46D50V54Rはp43ー58の46，50 54番 残 基 を そ れ ぞ れ ア ス パ ラ ギ ン 酸 （D） ， バ リ ン （V） ， ア ル ギ ニ ン （R） に 置 換） 。 T細 胞 増 殖 反応
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マウスに，完全フロインドアジュバントとぺプチド抗原のエマルジョンを皮下注し，所属リン パ節よりT細胞リッチな細胞分画を得た。この細胞を放射線照射同系マウス脾細胞，ペプチド抗 原と共に培養し， Hチミジン（TdR)の取り込み量を測定した。一部の実験では，培養開始か ら種々のモノクロナル抗体をヵ口えて培養した。
T細胞ハイブリドーマ
T細胞増殖反応と同様の方法で，マウスをぺプチド抗原で免疫して得られたT細胞を放射線照 射同系脾細胞，ペプチド抗原と共に混合培養した。細胞を回収し，T細胞リンパ腫細胞BV¥T5147 と細胞融合させ，クロ一二ングを行なった。
反応阻害実験
パラホルムアルデヒド液で固定した同系脾細胞と，T細胞ハイブリドーマを，刺激抗原，およ び阻 害ペ プチ ド 存在 下で混合培養した。培養 上清を回収し，IL―2依存細 胞CTLL―2とと もに培養し， H―TdRの取り込みを測定した。
結 果
Bl0（I一A゜，I←E―）と3R（I亠A゜，IーE゜/ ）を様々なペプチドで免疫した結果，
46D50V54RはBl0ではT細胞反応を誘 導しないが，3Rでは反応を 起こすことが判明した。つ まり46D50V54RはIーE゜／＾分子によって抗原提示を受けるが，I―A゜分子によっては抗原提 示されないと結論された。
p43一58類似ペプ チドの50番残基は，I−A拘束性のT細胞反応においてはエピトープとして 働く。そこで，I―E分子と結合する場合も50番残基がエピト―プとして機能するかを調べるた め，46D50V54Rを元 に50番残基を置換したペプチ ドを作成し，3Rマウスを免疫しT細胞反応 を調べたが，いずれも，免疫原に対して最も強い反応が見られた。従って，50番残基が，I― Eb/k分 子 拘 束 性 反 応 に お い て も エ ピ ト ー プ と し て 働 く こ と が 判 明 し た 。 次に，I―E゜/＾拘束性反応におけるアグレトープ部位を検討した。3Rマウスを46 D50V 54 Rで免疫し，46番と54番残基を置換したペプチドに対する反応性を調べると，46番，54番残基い ずれの置換によって も，T細胞増殖反応に変化が 生じた。さらに，46D50V54R特異的I―E拘 束性T細胞ハイブリ ドーマ3 RV11―11を用いて反 応阻害実験を行なった結果，46D50E54R， 46D50K54R，46D50L54Rは ，いずれ もほば等しい阻害能を示し た。また，50E 54R，46D50 E 54R，46D50Eを阻 害ペプチドとして用い，3RV11―11の反応に対する影響を比較すると，
50E 54R，46D50E54R，46D50Eの順 で阻害能が強かった。この順 番を50番残基Vのペプチド
の 刺 激 能の も の と 比 較 する と ，46と54番 目 のア ミ ノ 酸 モ チー フ が 一 致 し た。 以 上 よ り ，I ‑ E゜ ／＾ 分子拘 束性のT細 胞反応 におい て，p 43―58ア ナログ ペプチ ドの，46番，54番残基がアグ レ ト ー プ と し て 働 く と 結 論 さ れ た 。 同 様 の 実 験 を4R（I―A ，I E− ） とBR（I−A＾ ， I―E＾ ） に っ い ても 行 な い ，I一E＾分 子と の関係 でも，50番残 基がエ ピトー プ，46，54番残 基 がア グレト ープで ある 可能性 が示唆 された 。
同 じI―A分 子 を 持 ち ，IーE分 子 欠 損の 系 統 が 存 在 しな い 場 合 に は，I亠E拘 束性 の 反 応 を 調べ るため には， 抗原提示を抗クラス皿抗体でブ、ロックしたり，T細胞ハイブリドーマを作成し，
I―E拘 束 性 の 反 応を 示 す ク 口 一ンの 反応性 のみを 解析 しなけ ればな らない 。こ のよう な例と し て ，PLマ ウ ス （I―A ，I一E ） とSMマ ウ ス （IーA″ ，IーE″ ） を 用 い て 検 討 し た 。 多 く の ペ プ チ ド を 用 い て ，PLマ ウ ス で のT細 胞 増 殖 反応 を 調 べ る と，46R50V54Aに 対 し て 最 ． も 強い 反 応 が 見 ら れた 。 次 に46R50V54Aに 対 する 反 応 を 抗I−A抗 体 ， また は 抗I一E抗 体 で ブ 口 ッ ク す る と ， 抗I一A ， 抗IーE抗 体 い ず れ も 反 応を 抑 制 し ，46R50V54AはI一A ， I―E いずれ の分 子によ っても 抗原提 示を 受ける ことが 判明し た。
そ こ でPLの 場 合で も50番残 基 が エ ピ ト ープ と し て 機 能す る か を 調 べる た め ，46R50V54Aの 50番残 基 を 置 換 した ぺ プ チ ド で，T細 胞 反 応を 調 べ た 。46R50V 54Aと46R50E亅54Aは交 又反応 を 示 さ ず ，I―A，IE拘 束 性 反 応 い ず れ に おい て も ，50番 残 基 が エ ピト ー プ と し て機 能 す る と考 えられ た。
次 にPLマ ウ ス 由 来 の46R50V54A反 応 性T細 胞 ハ イ ブ リド ー マ を 作 成し ， そ の 反 応性 を 検 討 し た と こ ろ ，46R50V54Aの ほ か に46R50V54Dに 反 応 す る タ イ プ(46R型 ） と ，50V54A，46 A50V54Aな ど に 反 応 す る タ イ プ （54A型 ） が 見 い だ さ れ ，46R型 はI−A分 子 ，54A型 はI― E分 子拘 束 性 で あ った 。54A型のT細 胞 ハ イブ リ ド ー マを 用い， 反応阻 害実 験を行 なった 結果，
阻 害 能は46R50E 54A，46A50E 54Aの 順 に 強か っ た 。 こ の 順番 は46と54番 の モチー フが共 通で 50番残 基 がVの ペプ チ ド の 刺 激能 の 順 番 と 一致 し た 。 以上よ り，IーE 分 子との 関係て も，46 番 ，54番 残 基 は アグ レ ト ー プ である ことが 判明し た。SMマウス にっい ても ，同様 の方法 でアグ レ ト ー プ 残 基 を 解 析 し ， I― E″ 分 子 と 適 合 す る モ チ ー フ を 決 定 し 得 た 。
考 察
p43―58類似 ペ プ チ ド 上の ， 工 ピ ト ープ ， ア グレ 卜ープ 部位は クラ ス皿分 子の種 類（IーAま た はI―E） ， 及 び ハプ 口 夕イ プの違 いを越 えて保 存さ れてい た。こ のこと より， 抗原 骨格が 大 き く変 化しな い場合 ，抗 原とク ラスu分子 との結 合状態 はクラ スIIハ プ口夕 イプを 問わ ず，限 定
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さ れてお り， この結 合に関 与する ぺプチ ド抗 原上の アミノ 酸部位 や， クラスH分 子がぺ プチドを 結 合する 部位 も限定 される ことが 示唆さ れた 。
ア グレ トープ モチー フを同 定す ること が可能 となれ ば，免 疫反 応を惹起する可能性の高い抗原 部 位を予 想す ること もでき ，従来 ，試行 錯誤 的に行 なわれ てきた 反応 部位の解析や，ワヶチンの 開 発に， 演繹 的な方 法を導 入でき ると考 えら れる。
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査
教授 教授 教授
小 野 江 細 川 生 田
和 則 真 澄 男 和 良
ヘ ル パ ーT細 胞 の 活 性 化 は ， 主 要 組 織 適合 遺 伝 子 複 合 体（MHC)に コ ー ド さ れる ク ラ スH分 子 ，T細胞 抗 原 レ セ プタ 一 （TCR），抗 原分子 による 三分 子複合 体が形 成され るこ とによ り誘導 さ れ る 。こ の 際 ， 抗 原分 子 上 で ，TCRと 結 合 する 部 分 を エ ピ卜 一 プ ， ク ラスH分 子と結 合する 部分 をアグ レト ープと 呼ぶ。 本研究 では ，ハト チトク 口一厶c類 似ペプ チ、ドp43−58アナ口グ抗 原 を 用 い ， マ ウ スMHCク ラ スIIの ー つ ，I−E分 子 に 拘 束 さ れ るT細 胞 反 応 に お け る ぺ プ チ ド 抗 原 上の 機 能 部 位 （工 ピ 卜 ープ， アグ レトー プ）を 明らか にし， 次に 種々のI―E分子 に親 和 性の 強いア グレ トープ 上のア ミノ酸 モチ ーフを 決定し た。
多く の 合成ペ プチド 抗原 の中か ら，IーE分子 欠損系 のBl0マウス で免疫 原性 を示さ ないが ，｀
I一E陽 性 のB 10.A（3R） マ ウ ス でT細 胞 を 活 性 化 す る46D50V54Rペ プ チ ド が 決 定 され た 。 こ の 抗 原は ，IーE゜／ 拘 束 性 のT細 胞 反 応 をBl0．A（3R） で誘 導した 。また ，50番 目のア ミ ノ酸 をロイ シン ，アス パラギ ン酸， リジン，グルタミン酸ナょどに置換すると，それぞれのアミノ 酸 特 異 的反 応 が 誘 導 され た こ と か ら，IーE゜ ／＾ 拘 束性 のT細胞活 性化に おいて も46D50V 54R の50番残基 がエピ トープ として 働く ことが 判明し た。
次に ，I―E゜/＾ 拘 束 性 反応 に お け る アグ レ ト ー プ 部 位を 検 討 す る ため ，3Rマ ウス を46D50 V54Rで 免疫し ，46番 と54番残 基を置 換し たペプ チドに 対する 反応 性を調 べた。 その結果，46番，
54番残 基 いずれ の置換 によ っても ，T細胞増 殖反応 に変化 を生 じ，そ の抗原 活性は46，54番 残基 が ， そ れぞ れ ア ラ ニ ン， ア ル ギ ニ ン(46A54R） の も のが一 番強く ，次い でフ ェニル アラニ ン，
アルギニン，そしてアスパラギン酸，アルギニンの順であった。この抗原性が，ペプチド抗原と I―E分子の直接の結合性， 即ちアグレトープ効果によることを確認するため，46D50V54R特 異的I―E°／＾拘束性T細胞 ハイブリドーマ3R V11一11を用いて反応阻害実験を行った。3 RVハイブリドーマは，46D50V54R上のエピ卜一プの50番残基をバリンからグルタミン酸に置 換す ると 全く 反応 し ない が， この 置 換ペ プチ ド，46D50E54R， を46D50V54Rに対する3RV 反応系に加えると，46D50V54Rに対する反応は抑制された。っまり，刺激性のないペプチド抗 原もI―E分子と結合するため刺激活 性のある蝸D50V54RのI―E結 合を阻害し，その結果，
T細胞反応が抑制されたと考えられた。そこで50番残基がグルタミン酸，46，54番残基を種々の アミノ酸で置換した阻害ペプチドを合成して，その阻害能を比較した。その結果，46，54番残基 がアラニン，アルギニン(46A54R）が最も強く阻害し，次いでフェニルアラニン，アルギニン，
最後がアスパラギン酸，アルギニンの順で，これらのアグレトープモチーフはT細胞刺激活性の 場合と一致した。以上より，1―E゜／ 分子拘束性のT細胞反応にっいて，p 43―58アナ口グペ プチドの46番，54番残基がアグレトープとして働くと結論された。同様の実験をI―E欠損系の Bl0.A（4R） とI―E陽 性のBl0. BRにっいても行い，IーE＾分子 との関係でも50番残基が エ ピ ト ー プ ，46，54番 残 基 が ア グ レ ト ー プ で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 さ らに ，Bl0.PL，Bl0．SMマウス においても，I−E拘束性T細 胞ハイブリドーマを作製 して，同様の検索を行い，やはりp43―58類似ペプチド上の50番残基はエピトープ，46，54番残 基がアグレ卜一プとして働くことを明らかにした。また，I―E＾，I―E ，I―E″分子に親 和 性 の 強 い ア グ レト ープ モチ ー フを それ ぞれ46F 54R，46R54A，46R54Aと 同定 し た。
以上より，p43宀58類似ペプチド上のエピトープ，アグレト―プ部位は，分子の種類（IーA またはI―E）および，ハプ口夕イプの違いを越えて保存されていることが判明した。ただし，
個々のI―E分子に親和性を示すアグレトープ部位上のアミノ酸モチーフは，ハプ口夕イプに よって異なった。このことより，抗原骨格が大きく変化しない場合，抗原分子のクラスII分子と の結合形態は，クラスHハプロタイプを問わず限定されていること，しかしこの結合に関与する ペプチド抗原上のアミノ酸は，クラスH分子がペプチドを結合する部位のアミノ酸によって異な ると考えられた。従って， 個々のMHC分子に対するアグレ卜一プモチーフを同定すれば，免 疫反応を惹起する可能性の高い抗原部位を予想することもでき，従来試行錯誤的に行われてきた 反 応 部 位 の 解 析 や ， ワ ク チ ン 開 発 に ， 演 繹 的 な 方 法 を 導 入 で き る と 考 え ら れ た 。 論文発表に際し，細川，生田両教授より，工ピトープの異なるぺプチドによる抑制効果にっい て，アグレトープを欠く病原体由来のペプチド部分に対する免疫反応にっいて，アグレトープモ
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チーフを人工的に合成する妥当性にっいて，このような合成ペプチドヮクチンの副作用にっいて 質問があったが，申請者はおおむね適切な解答をなし得た。また両教授には個別にご審査いただ き合格と判定された。
以上， 本研究はマウスMHCクラスH分 子のーっであるi−Eを介す るT細胞反応における，
TCR，I―E，ペプチド抗原分子間の相互反応の詳細を明らかにした。このような基礎研究fま，
ウィルスなど種々の病原体に対するワクチン合成の基礎データとなり，博士（医学）の学位に相 当すると判定した。
