博士論文審査報告書

早稲田大学大学院  先進理工学研究科

博士論文審査報告書

論   文   題   目

合成ヘテロ

量体型コラーゲンペプチドの生化学 研究および新規バイオマテリアル開発への応用

Design and Synthesis of Heterotrimeric

Collagen-like Peptides and Their Applications to Biochemical Research and Development of

Biomaterials

申    請    者

山﨑

ちさと 

化学・生命化学専攻  生物分子化学研究

2010 年   2 月

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  コ ラ ー ゲ ン は 、 特 異 な 3 重 ら せ ん 構 造 を 特 徴 と し 、 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス の 主 要 な 構 成 成 分 と し て 存 在 す る 。 コ ラ ー ゲ ン は 、 様 々 な 組 織 に 機 械 的 な 強 度 を 与 え る 構 造 タ ン パ ク 質 と し て の 役 割 を 果 た す の み な ら ず 、 細 胞 の 接 着 、 遊 走 を 制 御 す る な ど 、 様 々 な 生 物 機 能 を 発 揮 す る 多 機 能 調 節 タ ン パ ク 質 と し て の 役 割 も 担 っ て い る 。 し か し な が ら 、 コ ラ ー ゲ ン の 生 合 成 過 程 や 代 謝 過 程 、 コ ラ ー ゲ ン が 発 揮 す る 生 物 機 能 に つ い て は 、 未 だ 明 ら か に さ れ て い な い 部 分 が 多 く 残 さ れ て い る 。 そ の 理 由 の 一 つ と し て 、 コ ラ ー ゲ ン は 不 溶 な 巨 大 タ ン パ ク 質 で あ り 、 水 溶 性 の 球 状 タ ン パ ク 質 を 対 象 と し て 発 展 し た 一 般 的 な タ ン パ ク 質 科 学 の 研 究 手 法 が あ ま り 有 効 で は な い こ と が 挙 げ ら れ る 。 こ の こ と か ら 、 化 学 合 成 し た コ ラ ー ゲ ン 様 ペ プ チ ド が 、 3 重 ら せ ん 構 造 の 解 析 な ど 、 コ ラ ー ゲ ン に 関 連 す る 研 究 に お い て 利 用 さ れ て き た 。  

  ヒ ト コ ラ ー ゲ ン に は 、 2 9 の 異 な る 型 が 存 在 し 、 そ の 中 に は 、 Ⅲ 型 コ ラ ー ゲ ン [α1 ( Ⅲ )₃] の よ う に 同 一 の ポ リ ペ プ チ ド 鎖 (α鎖 ) か ら な る ホ モ 3 量 体 、お よ び Ⅰ 型 コ ラ ー ゲ ン [α1 ( Ⅰ ) ₂ α2 ( Ⅰ ) ] の よ う な ヘ テ ロ 3 量 体 の 両 方 が 存 在 す る 。 各 α鎖 の 一 次 構 造 の 大 部 分 は   ( G l y - X - Y ) n の 繰 り 返 し か ら 成 り 、 X 位 に は P r o 、 Y 位 に は 4 - H y d r o x y p r o l i n e  ( H y p ) が 高 頻 度 で 出 現 す る 。 こ の た め 、 ( G l y - P r o - P r o ) n も し く は ( G l y - P r o - H y p ) n が 典 型 的 な コ ラ ー ゲ ン モ デ ル と し て よ く 利 用 さ れ て き た 。 こ の よ う な ペ プ チ ド は 自 発 的 に 3 重 ら せ ん 構 造 （ ホ モ 3 量 体 ） を 形 成 す る た め 、 コ ラ ー ゲ ン の 構 造 の 一 部 分 を 模 倣 で き る 。 し か し 、 こ の タ イ プ の ペ プ チ ド を 用 い て は 、 ヘ テ ロ 3 量 体 コ ラ ー ゲ ン の 3 重 ら せ ん 構 造 を 模 倣 す る こ と は 不 可 能 で あ る 。  

ヘ テ ロ 3 量 体 型 の コ ラ ー ゲ ン ペ プ チ ド を 作 製 す る た め に は 、 異 な る ペ プ チ ド 鎖 を 共 有 結 合 に よ っ て 架 橋 す る こ と が 一 つ の 方 策 で あ る 。 例 え ば 、 ペ プ チ ド の 配 列 中 に C y s 残 基 を 導 入 し 、 そ の 側 鎖 チ オ ー ル 基 の 選 択 的 保 護 ・ 脱 保 護 を 利 用 し た 位 置 選 択 的 な ジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成 を 行 う こ と で 、 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 で 結 ば れ た ヘ テ ロ 3 量 体 ペ プ チ ド を 合 成 す る こ と が 可 能 で あ る 。 こ の 方 法 を 用 い れ ば 、 ア ミ ノ 酸 配 列 の 異 な る 3 本 の ペ プ チ ド 鎖 を 自 由 に 組 み 合 わ せ た 分 子 を 構 築 で き 、 ま た 3 本 の ペ プ チ ド 鎖 を 相 互 に ず ら せ て 架 橋 す る こ と も 可 能 で あ る 。 本 論 文 で は 、 こ の よ う に し て 合 成 し た ヘ テ ロ 3 量 体 コ ラ ー ゲ ン ペ プ チ ド を 用 い て 、 コ ラ ー ゲ ン と タ ン パ ク 質 間 の 相 互 作 用 の 解 析 と 、 コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 マ テ リ ア ル の 開 発 を 行 っ て い る 。  

  本 論 文 は ６ 章 よ り 構 成 さ れ て い る 。  

  第 1 章 は 序 論 で あ り 、 本 研 究 の 背 景 に つ い て 述 べ て い る 。  

  第 2 章 で は 、コ ラ ー ゲ ン 特 異 的 分 子 シ ャ ペ ロ ン h e a t - s h o c k  p r o t e i n  4 7   ( H s p 4 7 ) が 認 識 す る コ ラ ー ゲ ン の 最 小 構 造 の 決 定 に つ い て 述 べ て い る 。

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H s p 4 7 は コ ラ ー ゲ ン の 生 合 成 に 必 須 の 分 子 シ ャ ペ ロ ン で あ る 。 H s p 4 7 の 機 能 を 明 ら か に す る た め に は 、ま ず 、H s p 4 7 と コ ラ ー ゲ ン と の 分 子 認 識 機 構 を 明 ら か に す る こ と が 重 要 で あ っ た 。 こ れ ま で の 研 究 か ら 、 H s p 4 7 が 高 ア フ ィ ニ テ ィ ー で 結 合 す る コ ラ ー ゲ ン の 構 造 は X - ( T h r / P r o ) - G l y - X - A r g と 記 述 で き る こ と が 分 か っ て い た 。 し か し 、 コ ラ ー ゲ ン の 3 重 ら せ ん 構 造 は 、3 本 の ポ リ ペ プ チ ド 鎖 が 互 い に 長 軸 方 向 に 1 残 基 分 ず つ ず れ た 構 造 を し て い る た め 、 Ⅰ 型 コ ラ ー ゲ ン の よ う な ヘ テ ロ 3 量 体 分 子 に お い て は 、 複 数 の 立 体 異 性 体 が 存 在 し 得 る 。 そ こ で 、H s p 4 7 が 認 識 す る Y⁰位   ( A r g ) と Y^{- 3}位 ( T h r ) が 3 重 ら せ ん 上 の い か な る 位 置 関 係 に あ る の か を 明 ら か に す る た め に 、 そ の 2 つ の ア ミ ノ 酸 の 立 体 配 置 が 異 な る 5 種 類 の ヘ テ ロ 3 量 体 ペ プ チ ド を デ ザ イ ン・合 成 し 、 こ れ ら と H s p 4 7 の 相 互 作 用 を i n  v i t r oの 結 合 実 験 に よ り 解 析 し た 。 そ の 結 果 、 H s p 4 7 は 、 同 一 α鎖 上 に あ る Y⁰位 の A r g と Y^{- 3}位 の ア ミ ノ 酸 側 鎖 を 認 識 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ の よ う な 知 見 は 、 従 来 の 天 然 コ ラ ー ゲ ン を 用 い た 研 究 か ら は 得 る こ と の で き な い 詳 細 な も の で あ り 、 本 研 究 で 採 用 し た 独 自 の 手 法 の 優 位 性 を 示 す も の と な っ た 。  

  第 3 章 で は 、 ペ プ チ ド の 自 己 集 合 能 を 利 用 し た コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 の 開 発 に つ い て 述 べ て い る 。 近 年 、 ペ プ チ ド の 自 己 集 合 能 を 利 用 し た 超 分 子 の 作 製 例 が 多 数 報 告 さ れ て い る 。 α- へ リ ッ ク ス や β- シ ー ト 構 造 を 基 本 と し た ペ プ チ ド 性 超 分 子 で は 、 さ ら に 高 次 な 構 造 で あ る 線 維 構 造 の 形 態 や ゲ ル と し て の 物 性 を も 制 御 し 、 そ れ を バ イ オ マ テ リ ア ル と し て 応 用 し た 例 も 報 告 さ れ て い る 。 し か し 、 コ ラ ー ゲ ン 様 3 重 ら せ ん 構 造 を 基 本 と し た ペ プ チ ド 性 超 分 子 に 関 す る 研 究 に つ い て は 、 報 告 が 少 な く 、 バ イ オ マ テ リ ア ル と し て の 応 用 研 究 は 進 ん で い な か っ た 。 本 章 で は 、3 本 の ペ プ チ ド 鎖 を 相 互 に ず ら せ て ジ ス ル フ ィ ド 結 合 で 架 橋 し た 3 量 体 ペ プ チ ド を 用 い て 、 ゲ ル 状 の 超 分 子 マ テ リ ア ル を 開 発 し た こ と を 報 告 し て い る 。 こ こ で は 3 本 の コ ラ ー ゲ ン 様 ペ プ チ ド 鎖 が 互 い に 長 軸 方 向 に ず れ た か た ち で 架 橋 さ れ た 、 自 己 相 補 的 な 形 状 を も つ 3 量 体 ペ プ チ ド を 合 成 し た 。 こ の よ う な ペ プ チ ド は 自 発 的 な 分 子 間 で の 3 重 ら せ ん 形 成 に よ り 自 己 集 合 し 、 伸 長 し た 3 重 ら せ ん 構 造 を 持 つ 超 分 子 を 形 成 し た 。 ま た 、 ペ プ チ ド に 適 当 な 親 水 性 ア ミ ノ 酸 を 導 入 す る こ と に よ っ て 、 こ の 超 分 子 を ゲ ル 化 さ せ る こ と に も 成 功 し た 。 こ の ゲ ル は 昇 温 に よ り ゾ ル と な り 、 そ の ゲ ル − ゾ ル 転 移 は 可 逆 的 で あ っ た 。 さ ら に 、3 本 の ペ プ チ ド 鎖 の ず れ の 長 さ が 異 な る 複 数 の 3 量 体 ペ プ チ ド を 用 い て 、 超 分 子 ゲ ル の 熱 安 定 性 を 比 較 し た と こ ろ 、 ゲ ル − ゾ ル 間 の 転 移 温 度 を 分 子 デ ザ イ ン に よ っ て 制 御 で き る こ と を 示 し た 。  

第 4 章 で は 、 細 胞 接 着 能 を 持 つ コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 の バ イ オ マ テ リ ア ル と し て の 応 用 に つ い て 述 べ て い る 。 こ こ で は 第 3 章 で 述 べ た コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 に 、 天 然 コ ラ ー ゲ ン 上 の 機 能 配 列 を 導 入 す る こ と で 、

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細 胞 の 振 る 舞 い を 調 節 す る こ と を 試 み て い る 。 例 と し て 、 イ ン テ グ リ ン 結 合 配 列 の 一 つ で あ る G l y - P h e - H y p - G l y - G l u - A r g   ( G F O G E R ) を ペ プ チ ド 鎖 中 に 含 む 自 己 相 補 的 3 量 体 ペ プ チ ド を デ ザ イ ン ・ 合 成 し た 。 合 成 し た ペ プ チ ド が 水 溶 液 中 で コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 を 形 成 し て い る こ と を 確 認 し た 後 、 そ れ を デ ィ ッ シ ュ 表 面 へ コ ー ト し た 。 そ の 上 に ヒ ト 線 維 芽 細 胞 （ H D F ） を 播 種 し 、 細 胞 の 形 態 観 察 お よ び 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 の 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 G F O G E R 配 列 を 含 む コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 上 で H D F は 特 異 的 な 細 胞 接 着 と そ れ に 伴 う 伸 展 を 示 し た 。ま た 、こ の コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 に 対 す る 細 胞 接 着 は イ ン テ グ リ ン α2β1 に よ る も の で あ る こ と を 証 明 し た 。 本 章 の 結 果 は 、 機 能 配 列 を 導 入 し た ペ プ チ ド を 自 己 集 合 さ せ て 作 製 し た コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 を 用 い る こ と で 、 特 定 の 受 容 体 を 介 し た 細 胞 の 振 る 舞 い を 人 為 的 に 制 御 で き る こ と を 示 し た も の で あ る 。 こ の よ う な 化 学 合 成 に 基 づ い た コ ラ ー ゲ ン 様 超 分 子 に は 、 複 数 の 機 能 性 ア ミ ノ 酸 配 列 を 組 み 合 わ せ て 導 入 す る こ と も 原 理 的 に 可 能 で あ る 。 本 研 究 で 開 発 し た 人 工 的 な コ ラ ー ゲ ン 模 倣 体 は 、 コ ラ ー ゲ ン 研 究 の 新 た な 手 法 と し て 有 望 で あ る だ け で な く 、 細 胞 工 学 へ の 応 用 を 視 野 に 入 れ た バ イ オ マ テ リ ア ル と し て も 今 後 の 応 用 が 期 待 で き る 。  

  第 5 章 は 総 括 で あ り 、本 研 究 に よ っ て 得 ら れ た 結 果 を ま と め て い る 。     第 6 章 は 実 験 項 で あ る 。  

  以 上 の よ う に 、 本 論 文 で は 化 学 合 成 し た ペ プ チ ド か ら な る コ ラ ー ゲ ン 模 倣 体 を 、 コ ラ ー ゲ ン 結 合 タ ン パ ク 質 に 関 わ る 研 究 に 効 果 的 に 用 い 、 分 子 シ ャ ペ ロ ン H s p 4 7 の コ ラ ー ゲ ン 認 識 機 構 の 詳 細 を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、 独 自 に デ ザ イ ン し た ヘ テ ロ ３ 量 体 ペ プ チ ド か ら 構 築 さ れ る 超 分 子 の バ イ オ マ テ リ ア ル と し て の 有 用 性 を 示 し た 。 こ れ ら の 成 果 は 、 生 化 学 の 基 礎 研 究 お よ び バ イ オ マ テ リ ア ル の 創 製 を 目 指 し た 応 用 研 究 の 発 展 に 貢 献 す る も の と 判 断 さ れ る 。 し た が っ て 、 本 論 文 は 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 論 文 と し て 価 値 あ る も の と 認 め る 。  

2 0 1 0 年 2 月  

審 査 員  

（ 主 査 ）   早 稲 田 大 学 教 授     博 士 （ 薬 学 ）（ 京 都 大 学 ）     小 出   隆 規       早 稲 田 大 学 教 授     医 学 博 士   （ 自 治 医 科 大 学 ） 寺 田   泰 比 古       早 稲 田 大 学 准 教 授   博 士 （ 農 学 ）（ 東 京 大 学 ）     中 尾   洋 一       東 京 薬 科 大 学 教 授   薬 学 博 士   （ 京 都 大 学 ）   野 水   基 義