早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博士論文審査報告書
論 文 題 目
ウサギ角膜上皮再構築能を有する幹細胞および 前駆細胞の同定とその性状に関する研究
Identification and cellular properties of stem/progenitor cells that are capable to reconstruct corneal epithelium
in the rabbit model
申 請 者
亀石 統子
Sumako KAMEISHI
生命理工学専攻 分子生理学研究
2016 年 2 月
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動 物 の 組 織 ・ 臓 器 を 構 成 す る 細 胞 に は 寿 命 が あ る 。 自 己 複 製 能 と 多 分 化 能 を も つ 組 織 幹 細 胞 か ら 派 生 し た 終 末 分 化 細 胞 は ， 寿 命 が 尽 き た 細 胞 と 入 れ 替 わ り ， 組 織 構 成 の 動 的 平 衡 と 機 能 的 恒 常 性 を 維 持 す る 。 発 生 学 に お け る 多 細 胞 生 物 の 組 織 形 成 や ， 血 液 学 領 域 に お け る 長 年 の 造 血 幹 細 胞 な ど の 研 究 蓄 積 を 背 景 に ， 個 体 発 生 の プ ロ セ ス を 経 ず し て ， 幹 細 胞 を 様 々 な 組 織 細 胞 へ 分 化 さ せ る 方 法 が 報 告 さ れ る よ う に な っ た 。 組 織 幹 細 胞 は 組 織 ・ 臓 器 に 希 少 な 細 胞 と し て 体 内 に 分 布 す る 。 組 織 幹 細 胞 を 同 定 し ， 未 分 化 な 組 織 前 駆 細 胞 を 経 て ， 特 定 機 能 を も つ 組 織 細 胞 に ま で 分 化 す る 過 程 を 詳 ら か に す る 研 究 で は ， 最 適 な 動 物 モ デ ル の 選 択 や ，様 々 な 実 験 手 法 の 確 立 が 必 須 と な る 。本 研 究 は ， 白 色 家 兎 （ ウ サ ギ ） の 前 眼 部 を モ デ ル 組 織 と し ， 組 織 構 成 細 胞 の 性 状 を 解 析 し ， 角 膜 を 含 む 前 眼 部 上 皮 組 織 の 構 築 過 程 や 恒 常 性 維 持 の 機 構 の 解 明 を 目 指 し た も の で あ る 。 本 論 文 は 次 の ７ 章 で 構 成 さ れ る 。
第 １ 章 で は ， 角 膜 組 織 再 生 の 研 究 の 基 礎 と な る 角 膜 組 織 や 上 皮 組 織 に 関 す る 知 見 ， 幹 細 胞 研 究 の 現 状 ， 先 端 的 な 再 生 医 療 へ の 期 待 が 解 説 さ れ て い る 。 角 膜 は 重 層 扁 平 上 皮 組 織 で あ り ， 上 皮 表 層 は 代 謝 に よ り 剥 が れ 落 ち る 。 し か し 基 底 層 の 上 皮 幹 細 胞 よ り 分 化 細 胞 が 派 生 し て 組 織 恒 常 性 を 維 持 す る 。 前 眼 部 角 膜 上 皮 細 胞 は ， 結 膜 組 織 と の 境 界 部 （ 輪 部 ） の 角 膜 上 皮 幹 細 胞 ， 前 駆 細 胞 に 由 来 す る 。外 傷 や 疾 患 に よ っ て 角 膜 中 央 へ 結 膜 組 織 や 血 管 が 浸 潤 す る と ， 角 膜 混 濁 に よ る 視 力 障 害 が 発 症 す る た め ， 角 膜 上 皮 再 建 が お こ な わ れ る 。
査 読 の 結 果 ， 眼 組 織 の 上 皮 幹 細 胞 だ け で は な く ， 上 皮 組 織 に 関 す る 広 い 知 見 と ， 関 連 研 究 の 歴 史 に 関 す る 記 載 の 拡 充 を 求 め た 。 そ の 結 果 ， 角 膜 上 皮 幹 細 胞 の 特 性 と 局 在 ，角 膜 の 再 生 過 程 を 明 ら か に す る 研 究 意 義 が 明 確 に な っ た 。
第 ２ 章 に は ， ウ サ ギ 角 膜 上 皮 欠 損 モ デ ル 確 立 を ま と め て い る 。 幹 細 胞 の 局 在 す る 輪 部 上 皮 組 織 と ，分 化 細 胞 が 局 在 す る 角 膜 上 皮 組 織 を 外 科 的 に 切 除 し ， 組 織 修 復 過 程 に お け る 細 胞 の 挙 動 や 基 底 膜 構 成 様 式 の 解 析 が 示 さ れ て い る 。
査 読 の 結 果 ， 実 験 の 記 載 内 容 は 明 確 で あ っ た が ， 実 験 動 物 に ウ サ ギ を 選 択 し た 理 由 の 明 示 を 求 め た 。 こ の 指 摘 に よ り ， 第 一 に ， ウ サ ギ と ヒ ト の 角 膜 組 織 の 大 き さ や 性 質 に は 類 似 性 が あ り ， ヒ ト へ 臨 床 応 用 す る 基 礎 に な る こ と ， 第 二 に ， 関 連 因 子 が 特 定 さ れ て お ら ず ， マ ウ ス な ど の 遺 伝 子 改 変 モ デ ル 解 析 が 適 用 で き な い こ と ，第 三 に ，眼 組 織 が 小 さ い マ ウ ス は 実 験 に 適 さ な い こ と ， な ど の 記 載 が 強 化 さ れ た 。
第 ３ 章 で は ， 短 期 お よ び 長 期 の 角 膜 上 皮 欠 損 モ デ ル の 確 立 と 比 較 解 析 結 果 が 示 さ れ て い る 。 上 皮 細 胞 マ ー カ ー を 指 標 に し て 眼 組 織 の 角 膜 ， 輪 部 ， 結 膜 組 織 に お け る 基 底 膜 分 子 群 を 詳 細 に 調 べ た 結 果 ， モ デ ル 眼 表 面 上 に 出 現 し た 角 膜 上 皮 様 細 胞 と 浸 潤 結 膜 上 皮 細 胞 の 境 界 部 に は ， 幹 細 胞 が 存 在 す る 輪 部 様 組 織 が 再 構 築 さ れ た 。 こ の 境 界 部 に は 上 皮 細 胞 ／ 間 葉 系 細 胞 マ ー カ ー を 共 発 現 す る 細 胞 が 存 在 し た 。 こ の こ と か ら 「 上 皮 幹 細 胞 は 間 葉 系 細 胞 様 の 表 現 型 を 有 す る ， も し く は 未 分 化 な 間 葉 系 細 胞 か ら 上 皮 細 胞 が 分 化 す る 」 と い う 仮 説 が 導 き 出 さ れ た 。
査 読 の 結 果 ， 実 験 の 展 開 と 結 果 の 整 理 ， 考 察 は 申 し 分 な い こ と を 認 め た 。
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第 4 章 で は ， ま ず 輪 部 組 織 に 存 在 す る 角 膜 上 皮 幹 細 胞 ・ 前 駆 細 胞 の 分 離 ， 純 化 ， 同 定 に つ い て 記 載 さ れ て い る 。 ウ サ ギ 細 胞 の 特 異 的 染 色 に 際 し て 利 用 で き る 抗 体 が 極 端 に 制 限 さ れ る た め ， ヘ キ ス ト 蛍 光 染 色 法 が 適 用 さ れ た 。 ヘ キ ス ト 蛍 光 染 色 細 胞 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ っ て ， 角 膜 上 皮 幹 細 胞 ・ 前 駆 細 胞 は S i d e p o p u l a t i o n（S P 画 分 ） に 分 離 す る こ と が で き た 。
査 読 の 結 果 ， S P 細 胞 分 離 の 最 適 条 件 検 討 の 記 載 強 化 を 求 め ，反 映 さ れ た 。 第 5 章 で は ，全 R N A シ ー ク エ ン シ ン グ に よ っ て ，輪 部 上 皮 S P 細 胞 と 非 S P 細 胞 の 遺 伝 子 発 現 を 比 較 し た 。 次 に シ ン グ ル セ ル q RT- P C R 解 析 に よ っ て S P 細 胞 に は 未 分 化 血 管 内 皮 細 胞 様 集 団 と 未 分 化 間 葉 系 細 胞 集 団 の 少 な く と も 2 つ の 集 団 を 含 む こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。
査 読 の 結 果 ，i n s i l i c o 解 析 に 至 る 一 連 の 流 れ の 図 示 を 求 め ， 反 映 さ れ た 。 第 6 章 で は ， 輪 部 上 皮 S P 細 胞 マ ー カ ー 候 補 の 探 索 結 果 を ま と め て い る 。 ウ サ ギ の 細 胞 を 対 象 に し て 初 め て ，d e n o v o ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ムア ッ セ ン ブ リ を 採 用 し ，角 膜 上 皮 幹 細 胞 マ ー カ ー 候 補 を 探 索 し た 。そ の 一 つ で あ る V c a m 1 は ， 上 皮 幹 細 胞 ， 前 駆 細 胞 が 局 在 す る 口 腔 粘 膜 上 皮 基 底 細 胞 と 小 腸 陰 窩 上 皮 細 胞 に 発 現 し た が ， 輪 部 上 皮 組 織 で は 確 認 で き な か っ た 。
査 読 の 結 果 ， 輪 部 上 皮 S P 細 胞 と ， 他 組 織 の 上 皮 幹 細 胞 と の 特 異 的 発 現 分 子 の 比 較 ，考 察 の 強 化 を 求 め た 。そ の 結 果 ，他 の 組 織 幹 細 胞 で 認 め ら れ る C D 3 4，
B m i 1 な ど の 発 現 が 輪 部 上 皮 S P 細 胞 は 共 通 し て 発 現 し て い る こ と な ど が 具 体
的 に 示 さ れ ， よ り 一 般 化 し う る 考 察 が 加 え ら れ た 。
第 7 章 で は ， 本 研 究 を 総 括 し ， 今 後 の 展 望 を 述 べ て い る 。
以 上 を ま と め る と 本 研 究 は ， ウ サ ギ 前 眼 部 の 輪 部 上 皮 S P 細 胞 を 解 析 し ， 角 膜 の 起 源 と な る 組 織 幹 細 胞 は ， 血 管 内 皮 も し く は 間 葉 系 様 の 表 現 型 を 有 す る 未 分 化 細 胞 で あ る こ と を 発 見 し た 。 眼 組 織 の 修 復 過 程 で 上 皮 ／ 間 葉 系 細 胞 が 出 現 す る こ と な ど よ り ， 上 皮-血 管 内 皮-間 葉 系 細 胞 の 相 互 作 用 や 分 化 転 換 が 上 皮 組 織 の 恒 常 性 維 持 に 重 要 で あ る 可 能 性 も 示 し た 。 こ れ ら の 知 見 は ， 将 来 の 角 膜 再 生 法 の 開 発 や 組 織 幹 細 胞 研 究 の 発 展 に 貢 献 す る 。 さ ら に ， ゲ ノ ム デ ー タ ベ ー ス が 未 完 成 で ， 実 験 ・ 分 子 解 析 に 制 約 が 多 い ウ サ ギ を 対 象 に し な が ら ，諸 手 法 を 巧 み に 組 み 合 わ せ ，生 物 学 の 実 験 展 開 の 道 筋 の 一 端 を 示 し た 。 よ っ て 本 論 文 は 博 士（ 理 学 ）の 学 位 論 文 と し て 相 応 し い も の で あ る と 認 め る 。
2 0 1 6 年 2 月 審 査 員
（ 主 査 ） 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 理 学 ）（ 早 稲 田 大 学 ） 加 藤 尚 志 早 稲 田 大 学 教 授 理 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 中 村 正 久 早 稲 田 大 学 名 誉 教 授 理 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 並 木 秀 男
