早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博士論文審査報告書
経 鼻 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン に よ り 誘 導 さ れ る 分 泌 型 I g A 抗 体
の 解 析
Analysis of Secretory IgA Antibody Induced by Intranasal Influenza Vaccine
申 請 者
齊藤 慎二
Shinji SAITO
生命医科学専攻 生命分子工学研究
2016 年 2 月
１ ． 博 士 論 文 要 旨
現 在 世 界 的 に 使 用 さ れ て い る 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン が 抗 原 性 の 異 な る 株 に 対 し て 効 果 が 低 い こ と か ら 、 自 然 感 染 を 模 倣 し た 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン が 次 世 代 ワ ク チ ン と し て 期 待 さ れ て い る 。 し か し な が ら 、 以 前 に 開 発 さ れ た 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 副 反 応 問 題 か ら 抗 原 や ア ジ ュ バ ン ト 、 製 剤 の 工 夫 に よ り 有 効 か つ 安 全 性 の 高 い ワ ク チ ン の 開 発 が 求 め ら れ て い る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 ワ ク チ ン 抗 原 の 動 態 解 析 を 行 う こ と に よ っ て 、 そ の 安 全 性 を 検 討 す る こ と 、 経 鼻 ワ ク チ ン に よ り 誘 導 さ れ る 免 疫 応 答 を 理 解 す る た め に 分 泌 型
I g A（s - I g A） 抗 体 の 解 析 を 行 っ た 。 本 博 士 論 文 は 、 五 章 で 構 成 さ れ て い る 。
第 一 章 で は 、 緒 言 と し て 本 研 究 の 背 景 や 未 だ 解 決 さ れ て い な い 問 題 点 、 今 後 の 展 望 に 関 わ る 知 見 等 を 纏 め 、 本 研 究 の 重 要 性 に 関 し て 簡 潔 に 記 述 し た 。
第 二 章 で は 、 ワ ク チ ン の 接 種 部 位 と な る 鼻 腔 領 域 内 及 び 全 身 で の 動 態 を 明 ら か に し 、 そ の 安 全 性 と 効 果 の 検 討 を 行 っ た 。 非 ヒ ト 霊 長 類 と マ ウ ス を 用 い て 解 析 し た 結 果 、 薬 剤 の 粘 膜 へ の 付 着 性 を 向 上 さ せ る 粘 稠 剤 カ ル ボ キ シ ビ ニ ル ポ リ マ ー
（C V P） を ワ ク チ ン に 添 加 し た 場 合 、 抗 原 の 中 枢 神 経 系 へ の 輸 送 ・ 蓄 積 や 肺 へ の
移 行 は 認 め ら れ ず 、 鼻 腔 領 域 へ の 滞 留 性 が 向 上 し I g A 抗 体 応 答 を 誘 導 可 能 な こ と を 示 し た 。 特 に 、 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト で あ る A m p l i g e n（ 合 成 二 本 鎖 R N A： p o l y I : p o l y C1 2U） と C V P を 組 み 合 わ せ た 経 鼻 全 粒 子 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン は 有 効 で あ り 、 約 1 年 後 に も ウ イ ル ス 感 染 が 抑 制 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。
第 三 章 で は 、 ワ ク チ ン の 経 鼻 接 種 に よ り ヒ ト で 誘 導 さ れ る 抗 体 産 生 形 質 細 胞 か ら 組 換 え モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し 、 そ の 特 性 解 析 を 実 施 し た 。A ( H 5 N 1 )ワ ク チ ン 接 種 に よ り 誘 導 さ れ た 抗 体 の ア イ ソ タ イ プ 解 析 よ り 、 経 鼻 ワ ク チ ン 接 種 は
I g A 抗 体 産 生 形 質 細 胞 が 多 く 誘 導 さ れ た こ と を 明 ら か に し 、A ( H 1 N 1 )と A ( H 5 N 1 )
の 異 な る 亜 型 の ウ イ ル ス に 中 和 活 性 を 示 す 広 域 中 和（b r o a d l y n e u t r a l i z i n g , b N）抗 体 の 単 離 に も 成 功 し た 。 経 鼻 ワ ク チ ン 接 種 に お い て も ウ イ ル ス 感 染 や 注 射 型 ワ ク チ ン 接 種 と 同 様 に b N 抗 体 が 誘 導 さ れ る こ と を 初 め て 示 し た 。
第 四 章 で は 、s - I g A 抗 体 の 四 量 体 を i n v i t ro で 作 製 す る 系 の 確 立 、 中 和 活 性 へ の 影 響 を 検 討 し た 。s - I g A 抗 体 は H 鎖 、L 鎖 、J 鎖 、 分 泌 因 子 （S C） か ら 構 成 さ れ て お り 、4 因 子 を 細 胞 へ 共 導 入 す る こ と に よ り 、四 量 体 I g A 抗 体（H 鎖 ：L 鎖 ：J 鎖 ： S C＝8：8：1：1） が 構 成 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 モ チ ー フ 探 索 に よ り 、C 末 領 域 の 4 5 8 番 目 ア ミ ノ 酸 が I g A 1 タ イ プ の バ リ ン で は な く I g A 2 m 2 タ イ プ の イ ソ ロ イ シ ン で あ る 場 合 に 四 量 体 化 が 促 進 さ れ る こ と を 見 出 し た 。 さ ら に 、 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス に 対 す る 中 和 活 性 は 、I g A 抗 体 の 四 量 体 化 に と も な い 増 強 さ れ る こ と を 明 ら か に し た 。 四 量 体 化 自 体 に 中 和 活 性 を 増 強 す る メ カ ニ ズ ム が 存 在 す る こ と を 示 唆 で き た こ と は 今 後 の ワ ク チ ン 設 計 に お い て 有 用 な 知 見 と な る 。
第 五 章 で は 、 本 研 究 の 総 括 を 行 っ た 。
本 研 究 に よ り 、 不 活 化 全 粒 子 抗 原 を 用 い た 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン
の 開 発 が 一 層 促 進 さ れ る こ と が 期 待 さ れ る だ け で な く 、 さ ら に 、 抗 原 量 の 減 量 や ア ジ ュ バ ン ト を 追 加 ／ 改 変 す る こ と に よ り 、 よ り 有 効 性 と 安 全 性 が 高 い ワ ク チ ン を 目 指 し た 開 発 研 究 が 促 進 す る と 考 え ら れ る 。
２ ． 公 聴 会 審 査 内 容
2 0 15 年 11 月 11 日 に 行 っ た 予 備 審 査 会 で の 質 疑 応 答 を 踏 ま え て 2 0 1 6 年 1 月
2 1 日 公 聴 会 を 開 催 し た 。 公 聴 会 で は 、 申 請 者 か ら 博 士 内 容 の 説 明 が 行 わ れ 、 質 疑 応 答 が 行 わ れ た 。 そ の 概 要 を 下 記 に 要 約 す る 。
１ ） 多 量 体 ワ ク チ ン や 広 域 中 和 抗 体 （b N 抗 体 ） の 理 論 的 な 誘 導 可 能 性 、 組 み 合 わ せ に よ る 可 能 性 に つ い て 質 問 が な さ れ た 。 そ れ に 対 し て 、 理 論 的 デ ザ イ ン は 難 し い こ と 、b N 抗 体 で は 、 可 能 性 が あ る こ と が 説 明 さ れ た 。 ま た 、 そ れ ら の 交 叉 中 和 能 の メ カ ニ ズ ム は 異 な る と 考 え ら れ る が 、b N 抗 体 を 誘 導 す る 抗 原 を 経 鼻 接 種 し た 場 合 に b N 抗 体 が 誘 導 さ れ 、 そ の 抗 体 が 多 量 体 I g A 抗 体 を 形 成 す る こ と で 、 相 加 的 に 交 叉 中 和 能 を 増 強 で き る 可 能 性 は あ る と 説 明 さ れ た 。 ２ ） サ イ ト カ イ ン の 誘 導 実 験 が 今 回 追 加 さ れ て い る 理 由 に つ い て 問 わ れ た 。 そ れ
に 対 し て 、C V P の ア ジ ュ バ ン ト 活 性 に つ い て の 指 摘 が 投 稿 論 文 の コ メ ン ト に あ っ た た め に 実 験 結 果 を 追 加 し た こ と が 説 明 さ れ た 。 骨 髄 由 来 の 樹 状 細 胞 で は 、 サ イ ト カ イ ン の 誘 導 効 果 は 認 め ら れ ず 、C V P に よ る 抗 体 の 誘 導 能 増 強 は 免 疫 担 当 細 胞 に よ る 摂 取 効 率 の 上 昇 が 重 要 で あ る こ と が 説 明 さ れ た 。
３ ）A m p l i g e n の サ イ ト カ イ ン 誘 導 能 が ほ と ん ど 無 い 理 由 と A m p l i g e n の 量 の 検 討
に つ い て 質 問 が な さ れ た 。 そ れ に 対 し て 、 分 解 さ れ や す い 二 重 鎖 R N A で あ る た め 、P o l y I : C よ り サ イ ト カ イ ン 誘 導 能 が 弱 く な る こ と は 予 想 し て い た こ と 、 量 に 関 し て は ワ ク チ ン 接 種 の 際 の 使 用 量 と 同 程 度 の 添 加 が 説 明 さ れ た 。
４ ）H 鎖 、L 鎖 、J 鎖 、S C の 共 導 入 系 と 共 培 養 系 の 実 験 を デ ザ イ ン し た 理 由 に つ い て 問 わ れ た 。 そ れ に 対 し て 、s - I g A 抗 体 は 生 成 過 程 で 2 種 類 の 細 胞 を 経 て 作 製 さ れ る と 考 え ら れ て い る こ と か ら 四 量 体 が 作 製 さ れ る 過 程 に お い て 、 小 胞 内 で 輸 送 さ れ て い る 二 量 体 が ト ラ ン ス サ イ ト ー シ ス の 間 に ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 形 成 し 四 量 体 が で き る 可 能 性 を 検 討 す る た め で あ る と 、 説 明 さ れ た 。
５ ）共 培 養 の p I g R と S C を 比 べ た 場 合 に S C の 方 が 多 量 体 形 成 を 促 進 し て い る こ と か ら 、 同 一 細 胞 内 で 多 量 体 が 形 成 さ れ る と 考 え る か 、 と の 質 問 が さ れ た 。 そ れ に 対 し て 、I g A 抗 体 で は 不 明 で あ る が I g M 抗 体 で は 抗 体 産 生 細 胞 内 で 五 量 体 の 形 成 が 示 唆 さ れ て い る こ と が 紹 介 さ れ 、今 回 の I g A 抗 体 も 細 胞 内 で 四 量 体 を 形 成 し て い る と 推 測 し て い る と 、 説 明 さ れ た 。
６ ）1 年 間 の 血 清 中 の 抗 体 応 答 の 推 移 に 関 す る 考 察 に つ い て 質 問 が な さ れ た 。 そ れ に 対 し て は 、 長 期 間 生 存 す る B 細 胞 の 存 在 が 紹 介 さ れ た 。A m p l i g e n の ア ジ ュ バ ン ト 活 性 に よ り 免 疫 担 当 細 胞 が 刺 激 さ れ 、B 細 胞 の 誘 導 や 生 存 に 関 わ る 環 境 も 誘 導 さ れ 、 抗 体 応 答 が 長 期 間 維 持 さ れ や す く な っ た と 考 え ら れ る こ と が 説
明 さ れ た 。
７ ）C V P が 抗 原 の 滞 留 性 を 向 上 さ せ て I g A 産 生 に つ な が る が 、そ の メ カ ニ ズ ム に 関 す る 考 察 が 少 な く 結 論 の 表 現 を 再 考 し て ほ し い こ と が 指 摘 さ れ た 。 そ れ に 対 し て 、 現 状 で は 、 実 験 的 に は 検 証 で き な い こ と か ら 今 後 の 課 題 と し て 、 論 文 中 に 加 筆 す る こ と と し た 。
８ ） 第 三 章 の 結 論 で は 、 経 鼻 ワ ク チ ン に つ い て の 結 論 と な っ て い る が 、 皮 下 接 種 と 比 較 し て 経 鼻 ワ ク チ ン で 特 有 な 結 果 な の か 、 と い う 質 問 が な さ れ た 。 そ れ に 対 し て 、 経 鼻 接 種 で は b N 抗 体 が 誘 導 さ れ る と い う 報 告 は ま だ な く 、 今 回 経 鼻 ワ ク チ ン に よ っ て も b N 抗 体 が 誘 導 さ れ る こ と を 初 め て 示 せ た こ と 、I g A 抗 体 産 生 細 胞 の 割 合 が 高 く な る こ と は 経 鼻 ワ ク チ ン に お い て 特 徴 的 な 現 象 と い え る こ と が 説 明 さ れ た 。
９ ） 本 研 究 で 得 ら れ た マ ウ ス 実 験 結 果 を 人 に 外 挿 は 可 能 か 、 と い う 質 問 が な さ れ た 。 基 本 的 に マ ウ ス の 免 疫 応 答 の 結 果 は ヒ ト へ 必 ず し も 外 挿 出 来 る わ け で は 無 く 、 ヒ ト に お け る 直 接 比 較 は 今 後 必 要 に な る と 説 明 さ れ た 。 今 回 実 施 し た 臨 床 試 験 （C V P 添 加 ワ ク チ ン は 6 名 で 、 非 添 加 ワ ク チ ン は 3 名 ） で は 、C V P の 添 加 の 有 無 に 関 係 な く I g A 抗 体 産 生 細 胞 の 割 合 が 最 も 高 く な る 傾 向 が 認 め ら れ 、 経 鼻 接 種 自 体 に I g A 抗 体 産 生 細 胞 を 誘 導 し や す い 特 徴 が あ る と の 説 明 が あ っ た 。 １ ０ ）本 方 法 に よ り 作 製 さ れ る 多 量 体 I g A 抗 体 に は 二 量 体 や 三 量 体 も 含 ん で い る
の で は な い か 、 と い う 質 問 が な さ れ た 。 ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 構 造 ご と に 分 取 し た も の を 使 用 し て お り 、 サ ン プ ル 中 に 含 ま れ て い る も の は ほ ぼ 四 量 体 と 考 え て い る と 説 明 さ れ た 。 そ れ に 対 し て 、H i g h - m as s M A L D I TO F の 結 果 等 か ら も 四 量 体 の サ ブ ユ ニ ッ ト 構 成 比 を 決 定 し て い る の で 、 明 確 に 四 量 体 の 構 成 が 8 : 8: 1 : 1 に な っ て い る と 表 記 し た ほ う が 良 い と コ メ ン ト が さ れ た 。
以 上 の 研 究 内 容 の 発 表 と 質 疑 応 答 を 通 じ 、 申 請 者 が 本 研 究 の 意 義 と 目 的 に 関 し て 十 分 に 理 解 し 、 本 研 究 に か か わ る 学 問 領 域 や 実 験 内 容 に 関 し て 幅 広 い 学 識 と 深 い 考 察 能 力 を 有 し て い る と 判 断 さ れ た 。 本 研 究 成 果 は 、 次 世 代 ワ ク チ ン と し て 期 待 さ れ て い る 経 鼻 不 活 化 イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン の 実 用 化 を 促 進 す る も の で あ り 、 主 査 お よ び 副 査 が 博 士 （ 工 学 ） の 学 位 論 文 と し て 相 応 し い と 判 断 し た 。
2 0 16 年 2 月
主 査 長 谷 川 秀 樹 国 立 感 染 症 研 究 所 感 染 病 理 部 部 長 、 早 稲 田 大 学 客 員 教 授 博 士 （ 医 学 ） 北 海 道 大 学
仙 波 憲 太 郎 早 稲 田 大 学 教 授 理 学 博 士 （ 東 京 大 学 ） 武 岡 真 司 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 工 学 （ 早 稲 田 大 学 ） 竹 山 春 子 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 工 学 ） 東 京 農 工 大 学
