博士論文審査報告書

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博士論文審査報告書

論 文 題 目

試験管内薬物代謝試験の適合を目指した新規 キメラタンパク質の発現と検証

Expression and evaluation of new chimera protein for drug metabolic assay

申 請 者

西田 有紀

Yuuki NISHIDA

ナノ理工学専攻 ナノバイオ材料研究

2016 年 2 月

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肝 細 胞 は 糖 、 脂 質 、 薬 物 や ア ル コ ー ル の な ど の 多 く の 物 質 の 代 謝 機 能 を 持 つ 細 胞 で あ る 。 医 薬 品 の 多 く は 肝 細 胞 に て 代 謝 さ れ 、 そ の 代 謝 産 物 が 様 々 な 副 作 用 を 引 き 起 こ す こ と が 知 ら れ て い る 。 こ の た め 医 薬 品 開 発 に は 代 謝 産 物 の 毒 作 用 や 副 作 用 の 予 測 は 必 要 不 可 欠 で あ り 、 そ の た め 創 薬 分 野 で の 薬 物 代 謝 試 験 は 非 常 に 重 要 で あ る 。 薬 物 代 謝 試 験 で は 、 ヒ ト 肝 臓 か ら 単 離 さ れ た ヒ ト 肝 細 胞 を 用 い る こ と が 望 ま し い 。 し か し 、 ヒ ト 肝 細 胞 は 採 取 や 培 養 が 困 難 で あ る な ど 問 題 点 が 多 い 。 が ん 細 胞 か ら 樹 立 さ れ た ヒ ト 肝 細 胞 株 は 無 限 増 殖 能 を も ち 、 培 養 が 容 易 で あ る こ と か ら 肝 細 胞 の 研 究 に 良 く 用 い ら れ る 。 し か し 、 肝 細 胞 株 は 本 来 の 機 能 が 欠 失 、 減 衰 し て い る た め 、 薬 物 代 謝 試 験 に 用 い る た め に は 機 能 向 上 さ せ る た め の 培 養 手 法 が 必 須 で あ る 。 そ こ で 、 様 々 な 手 法 を 用 い て 肝 細 胞 株 の 機 能 を 高 め る 試 み が な さ れ て い る 。 そ の ほ と ん ど は 生 体 内 の 細 胞 外 環 境 を 試 験 管 内 で 模 倣 す る も の で あ る 。 し か し 、 そ の 戦 略 で の 試 み は 薬 物 代 謝 試 験 に 用 い る に は 機 能 が 不 十 分 で あ る の が 現 状 で あ る 。 そ こ で 、 本 研 究 は 以 下 の 新 し い 概 念 と 戦 略 で 肝 細 胞 株 を 機 能 化 す る ナ ノ 培 養 シ ス テ ム の 開 発 を 試 み て い る 。

生 体 組 織 は 、 細 胞 外 環 境 と 細 胞 の 双 方 向 の シ グ ナ ル 伝 達 に よ っ て 維 持 さ れ て い る 。 多 く の 研 究 は そ の 細 胞 が 環 境 を 模 倣 す る も の で あ る が 、 本 研 究 で は そ の 中 で 最 も 重 要 と 思 わ れ る シ グ ナ ル 伝 達 だ け を 強 化 す る こ と で 肝 細 胞 の 機 能 化 を し よ う と す る も の で あ る 。 そ の 最 も 重 要 と 思 わ れ る シ グ ナ ル 伝 達 は 細 胞 外 の フ ァ イ ブ ロ ネ ク チ ン と 細 胞 の イ ン テ グ リ ン の 結 合 に よ る シ グ ナ ル 伝 達 で あ る と 申 請 者 は 考 え た 。 申 請 者 は こ の 結 合 を 強 固 な も の に す れ ば 、 肝 細 胞 の 機 能 を 向 上 さ せ る こ と が で き る の で は な か と い う 仮 説 を 立 て た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン の イ ン テ グ リ ン 結 合 部 位 ( C A S ) と コ ラ ー ゲ ン 結 合 部 位 ( C B D ) を 融 合 し た C B D - C A S キ メ ラ タ ン パ ク 質 を 作 製 し た 。こ の 新 規 キ メ ラ タ ン パ ク 質 は コ ラ ー ゲ ン の 足 場 材 料 に 結 合 し て 細 胞 の イ ン テ グ リ ン を 介 し て 結 合 を 強 固 に し て 、 そ の シ グ ナ ル 伝 達 を 促 進 す る と 期 待 さ れ る 。 コ ラ ー ゲ ン 分 子 は 長 さ 3 0 0 n m 、 幅 1 . 5 n m 繊 維 状 で 平 行 の 束 状 に 配 列 す る 。 C B D - C A S は タ ン パ ク 分 子 量 か ら 換 算 す る と 約 1 6 n m で あ り コ ラ ー ゲ ン 分 子 に 高 密 度 に 結 合 す る こ と が で き る 。 本 論 文 は 新 規 に 作 製 し た C B D - C A S を 用 い て ナ ノ レ ベ ル で 高 密 度 に コ ラ ー ゲ ン 足 場 材 料 に 固 定 化 し た 材 料 を 作 製 し た 。 こ の 材 料 で 肝 細 胞 の イ ン テ グ リ ン を ナ ノ レ ベ ル で ク ラ ス タ 化 す る こ と に よ り 肝 細 胞 株 H e p G 2 細 胞 の 機 能 化 を 検 証 し 、 薬 物 代 謝 試 験 に 応 用 可 能 か に つ い て 論 じ た も の で あ る 。

本 論 文 は ５ 章 か ら 構 成 さ れ て い る 。 第 一 章 で は こ の 分 野 の 現 状 と 背 景 、 問 題 点 及 び 本 研 究 の 仮 説 に つ い て 述 べ て い る 。

第 二 章 で は 、 キ メ ラ タ ン パ ク 質 の 作 製 に つ い て 述 べ て い る 。 ヒ ト フ ァ イ ブ ロ ネ ク チ ン c D N A か ら C B D と C A S の c D N A 断 片 を 抽 出 し 、 p C B D - C A S タ ン パ ク 質 発 現 ベ

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ク タ ー を 構 築 し た 。 こ の ベ ク タ ー を 大 腸 菌 に 導 入 し 、 大 腸 菌 に よ る タ ン パ ク 質 発 現 シ ス テ ム に よ り C B D - C A S キ メ ラ タ ン パ ク 質 を 作 製 し た 。 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト や 電 気 泳 動 法 に よ り 目 的 の タ ン パ ク 質 の 作 製 が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 コ ラ ー ゲ ン 結 合 ア ッ セ イ よ り 、 C B D - C A S に コ ラ ー ゲ ン 結 合 能 が 確 認 さ れ た 。 以 上 に 結 果 か ら C B D - C A S キ メ ラ タ ン パ ク 質 の 作 製 に 成 功 し た と 結 論 付 け て い る 。

第 三 章 で は 、 C B D - C A S を 固 定 化 し た コ ラ ー ゲ ン ２ 次 元 培 養 に お い て 、 C B D - C A S の 肝 細 胞 機 能 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 結 果 に つ い て 論 じ て い る 。 ま ず 、 肝 特 異 的 機 能 マ ー カ ー で あ る ア ル ブ ミ ン を 測 定 し た 。 そ の 結 果 、 C B D - C A S を 固 定 化 し た コ ラ ー ゲ ン ２ 次 元 培 養 は ア ル ブ ミ ン の 発 現 を 上 昇 さ せ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ の 結 果 か ら 申 請 者 は C B D - C A S を 固 定 化 す る こ と で 肝 細 胞 機 能 が 上 昇 し た と 結 論 付 け た 。 さ ら に こ の 機 能 上 昇 の 原 因 を 明 ら か に す る 目 的 で 、 イ ン テ グ リ ン の 細 胞 内 局 在 を 検 討 し た 。 C B D - C A S を 固 定 化 し た コ ラ ー ゲ ン 上 で は 接 着 斑 が 高 密 度 に 局 在 し 、足 場 材 料 と 細 胞 の イ ン テ グ リ ン と の 相 互 作 用 が 亢 進 し た と 考 え ら れ る 。 C B D - C A S に よ る イ ン テ グ リ ン を 介 し た 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 が 促 進 し た こ と は 、 F o c a l a d h e s i o n k i n a s e ( F A K ) の 上 昇 か ら も 明 ら か に な っ た 。 F A K は 、 細 胞 機 能 、 細 胞 遊 走 や 成 長 因 子 シ グ ナ リ ン グ 、 セ ル サ イ ク ル の 促 進 や 生 存 な ど を 含 む 様 々 な 細 胞 内 の プ ロ セ ス に 関 わ る こ と が 知 ら れ て い る 。以 上 の こ と か ら 、 申 請 者 は 高 密 度 に 配 置 さ れ た C B D - C A S は 、 肝 細 胞 株 H e p G 2 の 細 胞 表 面 の イ ン テ グ リ ン を ク ラ ス タ 化 し こ れ を 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 を 亢 進 し 肝 細 胞 機 能 を 上 昇 さ せ た と 結 論 付 け て い る 。

第 四 章 で は 、 第 二 章 で 作 製 し た キ メ ラ タ ン パ ク 質C B D - C A Sを ３ 次 元 足 場 構 造 体 で あ る ハ ニ カ ム コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ に 固 定 化 さ せ たC B D - C A S固 定 化 ハ ニ カ ム コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ を 作 製 し た 結 果 に つ い て 論 じ て い る 。肝 細 胞 特 異 的 機 能 マ ー カ ー で あ る ア ル ブ ミ ン は ２ 次 元 培 養 に 比 べ こ の ３ 次 元 培 養 で さ ら に 上 昇 し た 。そ こ で 薬 物 代 謝 試 験 に 重 要 な 薬 物 代 謝 遺 伝 子 で あ るC Y P遺 伝 子 群 の 発 現 を 検 討 し た と こ ろ 、C B D - C A S固 定 化 ハ ニ カ ム コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ は 肝 細 胞 株 に お い て こ れ ら の 遺 伝 子 の 発 現 を 上 昇 さ せ る こ と が で き た 。C B D - C A S固 定 化 ハ ニ カ ム コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ は 、i n v it r oに お い て 肝 細 胞 株 の イ ン テ グ リ ン を 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 を 活 性 化 す る こ と に よ り 機 能 を 高 め る こ と が で き 、薬 物 代 謝 試 験 に も 応 用 で き る 可 能 性 が 見 い だ さ れ た と 結 論 付 け て い る 。

第 五 章 で は 本 研 究 の 結 果 か ら 得 ら れ た 結 論 と そ の 考 察 お よ び 今 後 の 展 開 に つ い て 述 べ て い る 。

肝 細 胞 株 は 潜 在 的 に 高 い 機 能 を 持 っ て い る が 、 そ の 機 能 は 著 し く 低 下 し て い る 。 本 論 文 で は 、 新 規 キ メ ラ タ ン パ ク 質 を 用 い て 肝 細 胞 の イ ン テ グ リ ン の ク ラ ス タ 化 を 介 し た シ グ ナ ル 伝 達 を 活 性 化 す る こ と に よ り 肝 細 胞 の 機 能 を

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上 昇 さ せ る こ と に 成 功 し た 。 さ ら に 、 ３ 次 元 足 場 材 料 を 用 い る こ と に よ り 、 薬 物 代 謝 に 関 わ る 遺 伝 子 の 発 現 を 高 め る こ と が で き た こ と か ら 、 こ の 新 規 培 養 シ ス テ ム を 薬 物 代 謝 試 験 に 応 用 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。

以 上 、 本 研 究 に お い て 申 請 者 は 生 体 内 の 細 胞 外 環 境 を 模 倣 す る と い う 従 来 の 概 念 と は 異 な る 戦 略 を 用 い て 肝 細 胞 の 機 能 を 向 上 さ せ る こ と が で き る こ と を 初 め て 明 ら か に し て い る 。 こ の ユ ニ ー ク な 仮 説 は 分 子 生 物 学 や 細 胞 生 物 学 の 分 野 の 知 見 と ナ ノ バ イ オ サ イ エ ン ス を 融 合 し た も の で あ る 。 キ メ ラ タ ン パ ク 質 を 用 い て 特 定 の シ グ ナ ル 伝 達 だ け を 活 性 化 し て 肝 細 胞 を 機 能 化 す る と い う 視 点 で 検 討 し た 例 は 世 界 的 に 見 て も 皆 無 で あ り 、 こ の 分 野 の 道 を 開 く 非 常 に 独 創 的 な 研 究 で あ る 。 本 研 究 で 得 ら れ た 結 果 と 結 論 は よ り 機 能 的 な ナ ノ バ イ オ 材 料 の 設 計 に 有 用 な 知 見 と な る で あ ろ う 。 今 後 、 こ の 成 果 は 創 薬 支 援 研 究 分 野 の み な ら ず 、 ナ ノ バ イ オ 材 料 の 医 学 ・ 生 物 学 分 野 に 多 大 な 貢 献 を な す も の で あ り 、 今 後 の ナ ノ バ イ オ ・ ナ ノ メ デ ィ ス ン 分 野 や 薬 学 の 分 野 の 進 展 に 大 き く 寄 与 す る と 考 え ら れ る 。 本 研 究 は 理 学 、 特 に 分 子 生 物 学 や 細 胞 生 物 学 分 野 と 工 学 的 の 分 野 の 融 合 に よ り な さ れ た も の で あ り 、本 論 文 は 博 士（ 理 学 ） の 学 位 論 文 と し て 価 値 あ る も の と 認 め る 。

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審 査 員

（ 主 査 ） 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 薬 学 ） 東 邦 大 学 谷 口 彰 良

早 稲 田 大 学 教 授 工 学 博 士 東 北 大 学 庄 子 習 一

早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 工 学 ） 早 稲 田 大 学 谷 井 孝 至

物 質 ・ 材 料 研 究 機 構 博 士 （ 理 学 ） 東 京 大 学 中 西 淳