早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博士論文審査報告書
論 文 題 目
Manipulation of Nano Rod Proteins: ToMV and MfpA for Bionanoscience
申 請 者
Shama Sachin SHAH
シャー シャマ サチン
(Department of Life Science and Medical Bioscience, Research on Biomolecular Engineering)
2015 年 2 月
1 1 . 論 文 内 容 の 要 旨
ナ ノ サ イ エ ン ス と 生 物 学 の 融 合 は 、 ナ ノ バ イ オ サ イ エ ン ス と い う 新 た な 分 野 を 生 み 出 し た 。 本 論 文 で は 、 申 請 者 は 二 種 類 の ナ ノ ロ ッ ド 状 タ ン パ ク 質 を 対 象 と し て 、 一 方 の ナ ノ ロ ッ ド 状 タ ン パ ク 質 を 鋳 型 と し た バ イ オ ミ ネ ラ リ ゼ ー シ ョ ン に よ る 無 機 性 ナ ノ ロ ッ ド 状 構 造 体 の 開 発 と 、 も う 一 方 の ナ ノ ロ ッ ド 状 タ ン パ ク 質 は 生 化 学 的 な ア プ ロ ー チ に よ り そ の 活 性 の 検 証 を 行 っ た 。 ま ず 申 請 者 は 、植 物 ウ イ ル ス の 一 つ で あ る ト マ ト モ ザ イ ク ウ イ ル ス( t o m a t o m o s a i c v i r u s , ( To M V ) )を 用 い て ナ ノ マ シ ン 用 材 料 の 創 製 を 検 討 し た 。To M V は 長 さ 3 0 0 n m , 外 径 約 1 8 n m、 内 径 4 n m の チ ュ ー ブ 状 の 植 物 ウ イ ル ス で あ る 。 本 ウ イ ル ス は p H 3 – 1 0、9 0 C ま で 安 定 性 で あ る こ と か ら 、 バ イ オ ミ ネ ラ リ ゼ ー シ ョ ン の 鋳 型 に 適 す る 性 質 を 持 っ て い る 。 本 研 究 に て 申 請 者 は 、 単 純 な 湿 式 化 学 法 に よ り To M V の 表 面 に 白 金 粒 子 層 を 、 均 一 か つ 高 密 度 に コ ー テ ィ ン グ し た 。 そ の 後 、 タ ン パ ク 質 の 鋳 型 を ア ニ ー リ ン グ （4 0 0 ° C 4 h） に よ り 取 り 除 く こ と で 、 均 一 な 多 孔 性 の 白 金 ナ ノ チ ュ ー ブ の 作 製 に 成 功 し た 。 こ の 手 法 は 、 他 種 の 金 属 イ オ ン や そ の 酸 化 物 に も 使 用 で き る の で 、 誘 電 性 や 触 媒 能 を 持 つ 素 材 や セ ン サ ー の 開 発 に も 応 用 で き る こ と か ら 高 く 評 価 で き る 。 更 に 申 請 者 は ナ ノ チ ュ ー ブ 作 製 の 方 法 を よ り 発 展 さ せ て 、To M V の 空 洞 内 に 直 径
約 3 . 5 n m の 白 金 ナ ノ ワ イ ヤ を 作 製 し た 後 、外 側 を 直 径 5 0 n m 内 の 酸 化 鉄 で コ
ー テ ィ ン グ を 施 す 方 法 を 考 案 し て い る 。 還 元 剤 ア ス コ ル ビ ン 酸 を 利 用 し た
To M V 内 側 に お け る 白 金 の 核 生 成 は 、To M V 外 側 へ の 酸 化 鉄 コ ー テ ィ ン グ を
阻 害 し な か っ た 。 こ の デ ュ ア ル ・ ミ ネ ラ リ ゼ ー シ ョ ン に よ り 作 製 さ れ た ナ ノ 複 合 体 は 、 磁 性 材 料 や 電 極 触 媒 へ の 応 用 が 期 待 で き る 。
次 に 、申 請 者 は ナ ノ ロ ッ ド 状 タ ン パ ク 質 、M f p A ( M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s r e s i s t a n c e p r o t e i n A )の 機 能 に つ い て 従 来 知 見 の 検 証 を 行 っ た 。M f p A は 結 核 菌 (M y c o b a c t e r i u m t u b e rc u l o s i s)由 来 の D N A の 構 造 を 模 倣 し た タ ン パ ク 質 で あ る 。
M f p A を 含 む ペ ン タ ペ プ チ ド ・ リ ピ ー ト タ ン パ ク 質 で は 、5 つ の ア ミ ノ 酸 モ チ
ー フ の 連 続 に よ り 右 巻 き ら せ ん を 形 成 し 、B - D N A の 構 造 を 模 倣 す る 。M f p A は タ イ プ I I ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ の 一 つ で あ る D N A ジ ャ イ レ ー ス に 結 合 す る こ と が 知 ら れ て い る 。M f p A に は D N A ジ ャ イ レ ー ス の 阻 害 、 そ し て D N A ジ ャ イ レ ー ス 活 性 を キ ノ ロ ン 系 抗 菌 薬 か ら の 保 護 と い う 、2 つ の 矛 盾 し た 活 性 が 報 告 さ れ て い る 。 申 請 者 は 、 こ の M f p A の 活 性 メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る た め 、
D N A ジ ャ イ レ ー ス 、お よ び も う 一 つ の タ イ プ I I ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ で あ る To p o
I V を 用 い て 生 化 学 的 に 検 証 し た 。 得 ら れ た 結 果 は 、 液 中 の M f p A 活 性 は 数 々 の 要 因 に 影 響 さ れ る こ と を 示 し て お り 、 現 在 ま で の M f p A に 関 す る 矛 盾 し た 報 告 に 合 理 性 を 与 え る 可 能 性 を 含 ん で い た 。 現 在 の M f p A の 活 性 モ デ ル は 修 正 が 必 要 で あ り 、 当 論 文 内 の 研 究 結 果 は M f p A の 活 性 メ カ ニ ズ ム の 理 解 に 寄 与 す る も の で あ る 。
2 ２ ． 論 文 審 査 結 果
本 博 士 論 文 は 、 予 備 審 査 を 2 0 1 4 年 1 1 月 1 1 日 に 行 い 、2 0 1 4 年 1 2 月 2 4 日 に 公 聴 会 を 行 っ た 。 予 備 審 査 に お い て 多 く の 議 論 が 行 わ れ た が 、 そ れ ら を ふ ま え て 修 正 さ れ た 本 論 文 の 公 聴 会 で は 、 論 文 内 容 お よ び そ れ に 関 連 す る 事 項 に つ い て 試 問 し た 。 以 下 に 内 容 を 要 約 す る 。
１ ． テ ン プ レ ー ト の ア ニ ー リ ン グ 時 の 加 熱 温 度 を 4 0 0℃ と し た 理 由 と 、 異 な る 温 度 で の 検 討 が さ れ た の か ど う か 、 と い う 質 問 が な さ れ た 。 そ れ に 対 し て 、2 5 0℃ で 3 0 分 、4 0 0℃ で 4 時 間 、 さ ら に 6 0 0 ° C で 4 時 間 な ど に つ い て も 検 討 し た 結 果 、4 時 間 、4 0 0℃ の 加 熱 条 件 が 現 状 で は 最 適 と 判 断 し た こ と が 説 明 さ れ た 。
２ ． 他 グ ル ー プ の 類 似 研 究 と の 相 違 に 関 す る 説 明 が 求 め ら れ た 。To M V と 白 金 ナ ノ 粒 子 に 関 す る 他 グ ル ー プ の 研 究 で は 、D M A B を 還 元 剤 と し た 例 が あ る が 、 多 量 の ナ ノ 粒 子 が 外 表 面 に 沈 着 し て い る 。D M A B は 本 研 究 の w i r e - i n - t u b e の 形 成 に は 困 難 で あ る た め 用 い て い な い と 説 明 が あ っ た 。 ３ ． 野 生 型 To M V か ら 作 ら れ た プ ラ チ ナ ナ ノ チ ュ ー ブ の 構 造 は 、 本 来 の 形
と は 異 な る よ う に 見 え る と の 質 問 が あ っ た 。こ れ に 対 し て 、To M V の 両 端 が 接 合 し て い る 可 能 性 が あ り 、 更 に 、 ミ ネ ラ リ ゼ ー シ ョ ン 中 に 生 じ る 白 金 の 凝 集 に よ る 節 構 造 の 形 成 の 可 能 性 も あ る こ と が 回 答 さ れ た 。
４ ． プ ラ チ ナ ナ ノ ワ イ ヤ ー に は ど の よ う な 応 用 が 考 え ら れ る か と い う 質 問 が あ っ た 。 こ の 研 究 で 形 成 さ れ た プ ラ チ ナ ナ ノ ワ イ ヤ ー は 長 鎖 構 造 を 有 し て い る の で 、 電 池 材 料 と し て の 応 用 や 触 媒 と し て の 利 用 が 考 え ら え る こ と 、 白 金 は 高 価 で あ る の で こ の よ う な 少 量 で の 加 工 が 可 能 な も の の 利 用 は 優 位 性 が あ る こ と が 適 切 に 回 答 さ れ た 。
５ ． プ ラ チ ナ ナ ノ ワ イ ヤ ー 形 成 に 関 し て 、 何 故 ナ ノ チ ャ ネ ル の 内 部 に 形 成 さ れ る の か 、と い う 質 問 が な さ れ た 。内 部 に 形 成 さ れ る こ と に 関 し て は 、 P o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ( P V P )が 重 要 な 働 き を し て い る と 考 え て お り 、そ の 分 子 量 も 影 響 す る こ と が 回 答 さ れ た 。
６ ． 今 後 の 研 究 と し て 、 こ の プ ラ チ ナ ナ ノ ワ イ ヤ ー に 抗 が ん 剤 を 封 入 さ せ て 、 が ん 細 胞 に 特 異 的 に 投 与 す る こ と は 可 能 か 、 と い う 質 問 が さ れ た 。 シ ス プ ラ チ ン を 含 む ナ ノ 複 合 体 を が ん 細 胞(組 織)へ 直 接 導 入 し 、外 部 磁 界 を 印 加 す る こ と に よ っ て 、 ナ ノ 複 合 体 の 外 側 表 面 上 の 酸 化 鉄 を 発 熱 さ せ る こ と が で き 、 が ん 細 胞 を 死 滅 さ せ る こ と が 考 え ら れ る 、 ま た 、 異 な る 抗 体 を 表 面 に 導 入 す る こ と で 選 択 性 を 高 め る こ と が で き る 、 と の 説 明 が あ っ た 。
７ ． M f PA に 関 す る 今 後 の 研 究 の 展 望 に つ い て 意 見 が 求 め ら れ た 。 今 後
M f p A の C 末 端 に ヒ ス チ ジ ン タ グ 導 入 を 試 み 、活 性 と 凝 集 テ ス ト を 行 う こ
と 、M f PA と ジ ャ イ レ ー ス 、 特 に ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ I V と の 作 用 メ カ ニ ズ
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ム を 解 析 す る と 説 明 さ れ た 。 ま た 、 リ ア ル タ イ ム モ ニ タ リ ン グ 実 験 の た め の 高 速 原 子 間 力 顕 微 鏡 で の 観 察 に 関 し て は 、 現 時 点 で は 基 板 の マ イ カ
上 に D N A が 吸 着 し て し ま い ジ ャ イ レ ー ス が 結 合 で き な い 等 の 問 題 が あ る
こ と か ら 、 観 察 条 件 の 最 適 化 に よ っ て 単 一 分 子 で の 観 察 が 可 能 と な り 、 こ れ ら の 研 究 を 通 じ て M f p A の 活 性 メ カ ニ ズ ム が よ り 明 ら か に な る と 説 明 さ れ た 。
こ れ ら の 質 疑 応 答 は 適 切 で あ る と 判 断 し た 。
以 上 よ り 本 学 位 論 文 で は 、To M V と M f p A と い う 2 種 類 の ナ ノ ロ ッ ド 状 タ ン パ ク 質 を 用 い て To M V で は 化 学 的 な さ ま ざ ま な 手 法 を 検 証 し な が ら ナ ノ 複 合 体 を 作 る と い う 発 展 的 な 研 究 を 、M f p A で は 活 性 メ カ ニ ズ ム 解 明 と い う よ り 基 礎 的 研 究 を 遂 行 し た 。 そ れ ぞ れ 、 ナ ノ サ イ ズ の バ イ オ 分 子 を タ ー ゲ ッ ト と し 新 し い 手 法 や 知 見 を 見 出 し て い る 。 さ ら に 、 研 究 成 果 だ け で な く 、 関 連 し た 研 究 に 対 し て の 深 い 理 解 と 研 究 者 と し て の 能 力 、 資 質 も 十 分 認 め ら れ た こ と に よ り 、 申 請 者 は 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る に ふ さ わ し い と 判 断 し た 。
2 0 1 5 年 2 月
主 査 竹 山 春 子 博 士 ( 工 学 ) 早 稲 田 大 学 理 工 学 術 院 教 授
副 査 武 岡 真 司 工 学 博 士 早 稲 田 大 学 理 工 学 術 院 教 授
副 査 朝 日 透 博 士 ( 理 学 ) 早 稲 田 大 学 理 工 学 術 院 教 授
副 査 J o n a t h a n H e d d l e 博 士 ( 生 化 学 ) 理 化 学 研 究 所 国 際 主 幹 研 究 員
