博士論文審査報告書

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博士論文審査報告書

論 文 題 目

アフリカツメガエル成体の造血生理に関与する 蛋白質群の生物学的特性に関する研究

Studies on biological properties of proteins involved in the physiology of hematopoiesis

in adult Xenopus laevis

申 請 者

永澤 和道 Kazumichi NAGASAWA

生命理工学専攻 分子生理学研究

2015 年 7 月

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造 血 系 は 脊 椎 動 物 が 共 通 し て も つ 必 須 の 生 命 維 持 機 構 で あ る 。 造 血 幹 細 胞 を 起 源 と す る 末 梢 血 球 の 産 生 は 恒 常 的 に 維 持 さ れ ， 内 部 ・ 外 部 の 環 境 に 応 じ て 動 的 に 調 節 さ れ る 。 造 血 生 理 に 関 す る 研 究 は ， ヒ ト 臨 床 と 連 鎖 し て 主 に マ ウ ス を モ デ ル 動 物 に し て 展 開 さ れ て き た 。2 0 0 3 年 に ヒ ト 全 ゲ ノ ム 解 読 が 完 了 し て 以 降 ， 生 体 内 分 子 群 の 「 総 体 」 を 包 括 解 析 す る オ ミ ク ス （o m i c s） 手 法 が 急 速 に 普 及 し た 。 特 に ， 生 命 現 象 の 直 接 の 担 い 手 で あ る 蛋 白 質 を 解 析 す る プ ロ テ オ ミ ク ス （p r o t e o m i c s） に よ っ て ， 生 体 機 能 の 調 節 応 答 に 特 異 的 な 蛋 白 質 の 量 的 変 化 を 網 羅 的 に 捉 え る こ と が 可 能 に な り ， 特 に ヒ ト 臨 床 に 資 す る 創 薬 標 的 分 子 や 診 断 バ イ オ マ ー カ ー の 探 索 や 病 態 解 析 に 応 用 さ れ て い る 。 し か し ， ゲ ノ ム 情 報 の 利 用 技 術 で あ る こ と か ら ， 非 モ デ ル 動 物 は も と よ り ， 脊 椎 動 物 全 般 へ の 適 用 例 は 乏 し い 。

本 研 究 は ，脊 椎 動 物 の 造 血 生 理 の 普 遍 性 や 多 様 性 を 解 明 す る 端 緒 と す べ く ， 両 生 類 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル （X e n o p u s l a e v is） の 赤 血 球 造 血 を 対 象 に 着 手 さ れ た 。 造 血 生 理 に つ い て 他 の 生 物 種 と 比 較 す る た め に ， ま ず 単 分 子 の 構 造 と 機 能 に 着 目 し ， 赤 血 球 産 生 因 子 エ リ ス ロ ポ エ チ ン （e r y t h r o p o i e t i n，E P O） の 分 子 性 状 と 構 造 活 性 相 関 を 解 析 し た 。 次 に 単 分 子 か ら 多 分 子 の 動 態 へ ， 造 血 生 理 を 理 解 す る 視 野 を 拡 大 し ， 血 液 ・ 造 血 系 の 低 温 環 境 応 答 に つ い て プ ロ テ オ ミ ク ス を 適 用 し て 解 析 を 行 っ た 。 本 論 文 は 6 章 か ら 構 成 さ れ て い る 。 以 下 に 各 章 の 概 要 と 評 価 を 述 べ る 。

第 1 章 で は ， 本 研 究 の 背 景 と 目 的 ， 実 験 展 開 を 概 説 し て い る 。E P O を 中 心 と す る 造 血 制 御 に 関 す る 知 見 を 述 べ ， 研 究 の 課 題 ， 問 題 点 を 述 べ て い る 。 ま た ，ゲ ノ ム 解 読 後 の パ ラ ダ イ ム シ フ ト を 概 説 し ，本 研 究 の 意 義 を 示 し て い る 。 第 2 章 で は ， ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の E PO（x lE P O） に 対 す る 特 異 抗 体 の 作 出 と そ れ ら の 性 質 を 述 べ て い る 。x lE P O 部 分 ペ プ チ ド 3 種 （P 1；7 – 2 3 位 ， P 2；4 4 – 5 7 位 ，P 3；1 0 9 – 1 2 2 位 ） を ウ サ ギ に 免 疫 し ， ペ プ チ ド 抗 体 を 作 出 し た 。こ の う ち ヒ ト E PO（h u E P O）の 受 容 体 結 合 部 位 に 相 同 な 領 域 を 含 む P 1， P 2 に 対 す る 抗 体 は i n v it ro 中 和 活 性 を 有 し た こ と か ら ， エ ピ ト ー プ 領 域 は x lE PO 活 性 の 発 揮 に 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た ，H i s 6 -x lE PO を 免 疫 し ， ウ サ ギ 抗 x lE PO ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 ， マ ウ ス 抗 x lE PO モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 出 し ，一 連 の 抗 体 を 組 み 合 わ せ て x lE P O の 検 出 ・ 定 量 や ，受 容 体 結 合 領 域 の 解 析 が 可 能 に な っ た 。

第 3 章 で は ，x lE P O の 分 子 性 状 と 構 造 活 性 相 関 に つ い て 述 べ て い る 。約 8 0 種 も の 生 物 で E P O 遺 伝 子 配 列 の 存 在 を 認 め る が ， 哺 乳 類 以 外 で は E P O の 分 子 性 状 や 構 造 活 性 相 関 は 不 明 で あ る 。h u E PO と の ア ミ ノ 酸 配 列 相 同 性 が 3 8 % と 低 い に も 関 わ ら ず ，x lE P O は h u E PO 受 容 体 発 現 細 胞 の 増 殖 を 刺 激 し た 。 ま た 哺 乳 類 E P O の 3 か 所 の N 結 合 型 糖 鎖 付 加 部 位 は ， 受 容 体 結 合 領 域 か ら 外 れ て い る と 考 え ら れ る 。 し か し x lE PO で は ど の N 結 合 型 糖 鎖 付 加 も 欠 失 す る 。 以 上 よ り ，「x lE PO と h u E P O の 受 容 体 結 合 領 域 に は 共 通 構 造 が あ り ， h u E PO の N 結 合 型 糖 鎖 付 加 部 位 （A s n 2 4，As n 3 8，A s n 83） と 相 同 な N 結 合

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型 糖 鎖 導 入 x lE P O の 活 性 は 消 失 し な い 」 と 仮 説 を 立 て た 。 そ し て N 結 合 型 糖 鎖 付 加 コ ン セ ン サ ス 配 列 （N C S） を 変 異 導 入 し た ヒ ト 型 N C S 変 異 x lE PO を C O S - 1 細 胞 で 発 現 さ せ て 実 験 検 証 し た 。2 4 位 お よ び 3 8 位 に N C S を 導 入 し た x lE P O に は N 結 合 型 糖 鎖 が 付 加 さ れ た が ，8 3 位 N CS 変 異 x lE P O に は 糖 鎖 が 付 加 さ れ な い 分 子 を 認 め た 。こ の こ と か ら ，2 4 位 ，3 8 位 周 辺 の x lE P O の 立 体 構 造 は h u E P O と 類 似 し て い る が ，8 3 位 周 辺 で は 異 な る と 考 え ら れ た 。 ま た ，x lE P O は h u E PO よ り も 塩 基 性 お よ び 疎 水 性 が 高 い が ， 糖 鎖 導 入 に よ り 塩 基 性 は 低 下 し ， 親 水 性 が 上 昇 し た 。x lE P O の i n vi tr o 生 物 活 性 は 糖 鎖 付 加 に よ り 消 失 は し な い が ，x lE P O 受 容 体 結 合 を 介 し た 生 物 活 性 は 低 下 し た 。 し か し h u E P O 受 容 体 に 対 し て の 変 化 は 認 め な か っ た 。 従 っ て ，x lE P O の 受 容 体 結 合 領 域 は ，h u E P O と 同 様 に 2 4 位 ，3 8 位 周 辺 以 外 に 位 置 す る が ， E PO - E PO 受 容 体 の 立 体 配 置 は 両 生 物 種 で 異 な る こ と を 示 し た 。

第 4 章 で は ， 質 量 分 析 に よ る ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル と ネ ッ タ イ ツ メ ガ エ ル の 血 漿 蛋 白 質 の 網 羅 的 同 定 の 比 較 を 述 べ て い る 。 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル は ゲ ノ ム 解 読 の 途 上 に あ り ， プ ロ テ オ ミ ク ス が 有 効 で あ る 確 証 が な か っ た 。 一 方 ， 近 縁 種 ネ ッ タ イ ツ メ ガ エ ル の 全 ゲ ノ ム 情 報 は 公 開 さ れ た 。 等 量 の 両 ツ メ ガ エ ル 血 漿 を 採 取 し ， 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ–タ ン デ ム 質 量 分 析 装 置 （L C – M S / M S） で 分 析 し ， 帰 属 同 定 数 を 比 較 し た 。 そ の 結 果 ， 予 想 に 反 し て 両 者 に 大 差 は な く ， 機 能 注 釈 が 付 与 さ れ た 蛋 白 質 が 占 め る 割 合 は ， む し ろ ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の 方 が 高 か っ た 。 以 上 よ り ， 生 物 学 実 験 の 対 象 と し て 長 い 歴 史 を も つ ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル は ，ゲ ノ ム 情 報 が 未 整 備 で あ り な が ら 遺 伝 子 転 写 産 物 E S T に 関 す る デ ー タ ベ ー ス 登 録 情 報 の 蓄 積 が 豊 富 で あ り ， プ ロ テ オ ミ ク ス の 適 用 が 可 能 で あ る こ と ， 分 子 機 能 解 釈 に も 耐 え う る こ と を 確 認 し た 。

第 5 章 で は ， ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 成 体 に お け る 血 液 ・ 造 血 系 の 低 温 環 境 応 答 に つ い て 述 べ て い る 。 環 境 温 度 は 生 物 が 常 に 曝 さ れ る 外 部 環 境 の 一 つ で あ る 。 高 温 ・ 低 温 ス ト レ ス に 応 答 し た 造 血 生 理 ・ 調 節 系 が 存 在 す る 可 能 性 が あ る 。 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル は 5 ° C の 低 温 環 境 下 で 汎 血 球 減 少 症 を 呈 し ， 赤 血 球 減 少 の 一 因 は 肝 臓 で の 赤 血 球 破 壊 亢 進 で あ る 。 し か し ， そ の 分 子 機 序 や 連 鎖 す る 生 体 反 応 は 不 明 で あ っ た 。 そ こ で ， ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の 造 血 器 官 で あ る 肝 臓 お よ び 血 漿 を 対 象 に し て ， 対 照 群 （2 2 ° C） と 5 ° C 低 温 環 境 曝 露 2 4 時 間 後 の 群 と で ，L C – M S / M S 分 析 に よ る 蛋 白 質 の 網 羅 的 同 定 を 実 施 し た 。次 い で そ れ ら の 群 間 量 比 解 析 ， 遺 伝 子 オ ン ト ロ ジ ー 解 析 ， パ ス ウ ェ イ 解 析 を 進 め た 。 そ の 結 果 ， 低 温 曝 露 下 の 血 漿 蛋 白 質 の 増 減 プ ロ フ ァ イ ル よ り ， 赤 血 球 数 の 減 少 は 赤 血 球 破 壊 亢 進 お よ び 溶 血 に 起 因 し て い る こ と ， そ こ に は 抗 体 や 補 体 が 関 与 す る 可 能 性 が あ る こ と が 示 さ れ た 。 こ の 特 性 は ， ヒ ト に お け る 血 球 貪 食 症 候 群 や 自 己 免 疫 性 溶 血 性 貧 血 に 相 当 し た 。 同 様 に ， 栓 球 数 の 減 少 は 播 種 性 血 管 内 凝 固 症 候 群 に 相 当 し ， 栓 球 減 少 は 血 管 内 凝 固 に よ る 栓 球 の 消 費 が 一 因 で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。肝 臓 の 蛋 白 質 群 の 増 減 プ ロ フ ァ イ ル か ら は ， 対 照 と 低 温 曝 露 群 に 共 通 し て 有 意 に 抽 出 さ れ た パ ス ウ エ イ の 一 つ ， 糖 代 謝 系

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に 着 目 し た 。 低 温 曝 露 群 で は 解 糖 系 律 速 酵 素 と グ リ コ ー ゲ ン 合 成 系 酵 素 の 減 少 ， グ リ コ ー ゲ ン 分 解 律 速 酵 素 の 増 加 を 認 め た こ と か ら ， 解 糖 の 抑 制 と ， グ リ コ ー ゲ ン 分 解 の 亢 進 が 示 唆 さ れ た 。 実 際 に 肝 臓 中 グ リ コ ー ゲ ン 量 を 実 測 し た と こ ろ ，低 温 曝 露 群 で は 低 値 で あ っ た 。次 に グ リ コ ー ゲ ン の 増 減 に つ い て ， グ ル コ ー ス 産 生 ， グ リ セ ロ ー ル 産 生 ， ペ ン ト ー ス–リ ン 酸 経 路 に お け る N AD PH 産 生 と 関 連 付 け て 実 測 し て 検 証 し た 。 そ の 結 果 ， 肝 臓 中 の グ ル コ ー ス 量 は 低 温 曝 露 群 で 低 く ， グ リ セ ロ ー ル 量 ，N A D P，N AD P H 量 に は 差 を 認 め な か っ た 。 一 般 に 酸 化 ス ト レ ス が 生 じ る と ，N A D P H は 抗 酸 化 物 質 の 供 給 に 消 費 さ れ る 。 そ し て 肝 臓 の 組 織 所 見 で は ， 低 温 曝 露 に お い て 鉄 の 集 積 を 認 め る こ と か ら 酸 化 ス ト レ ス が 生 じ て い る と 考 え ら れ た 。 こ れ ら を ま と め て 解 釈 し ， 低 温 環 境 下 の ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル の 肝 臓 で は ， 破 壊 赤 血 球 に 由 来 す る 鉄 の 集 積 に よ る 酸 化 ス ト レ ス の 発 生 に 対 応 し ，抗 酸 化 物 質 を 供 給 す る た め に ， グ リ コ ー ゲ ン の 分 解 を 亢 進 さ せ N A D P H 産 生 を 維 持 し て い る ， と 結 論 し た 。 最 終 章 で は ， 本 研 究 の 成 果 を 総 括 し ， 今 後 の 研 究 展 開 に 関 す る 展 望 を 示 し て い る 。

以 上 を ま と め る と 本 研 究 は ，ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 成 体 の 造 血 解 析 プ ラ ッ ト ホ ー ム を 構 築 し ， 単 分 子 の 構 造 活 性 相 関 解 析 と ， 環 境 応 答 モ デ ル に お け る 複 数 分 子 群 の 量 的 変 動 解 析 を 進 め ， 異 な る 階 層 の 視 点 か ら 造 血 制 御 ・ 代 謝 調 節 に 連 鎖 す る 蛋 白 質 群 を 捉 え た 。脊 椎 動 物 が も つ 造 血 生 理 の 普 遍 性 と 多 様 性 に 関 す る 今 後 の 領 域 展 開 に と っ て 極 め て 重 要 な 成 果 で あ る 。 さ ら に ， 実 践 的 な プ ロ テ オ ミ ク ス を ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル に 適 用 し ， 新 た な 解 析 手 段 の 有 用 性 を 実 証 し た 。 こ の こ と は 非 モ デ ル 動 物 の モ デ ル 動 物 化 ，と い う 現 代 生 物 学 の 時 代 の 流 れ の 中 で 注 目 に 値 し ，モ デ ル 動 物 か ら 展 開 す る ヒ ト の 疾 病 病 態 の 解 明 へ 繋 が る 新 基 盤 と な る 。 基 礎 お よ び 応 用 の 両 面 か ら 本 研 究 の 価 値 は 極 め て 高 い 。 よ っ て 本 論 文 は 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 論 文 と し て 相 応 し い も の で あ る と 認 め る 。

2 0 15 年 7 月 審 査 員

（ 主 査 ） 早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 理 学 ）（ 早 稲 田 大 学 ） 加 藤 尚 志

早 稲 田 大 学 教 授 理 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 中 村 正 久

早 稲 田 大 学 教 授 理 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 筒 井 和 義

早 稲 田 大 学 客 員 教 授 医 学 博 士 （ 大 阪 大 学 ） 落 谷 孝 広