博士論文審査報告書

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博士論文審査報告書

論 文 題 目

Detection of biomarkers using field effect transistor (FET)-based biosensor

for disease diagnosis

疾患診断に向けた電界効果トランジスタ型 バイオセンサを利用した

バイオマーカーの検出

申 請 者

Shanshan Cheng 程 姍姍

Department of Nanoscience and Nanoengineering Research on Electrochemical Nano-Systems

2015 年 7 月

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疾 患 の 早 期 発 見 と 適 切 な 治 療 は 患 者 の 生 存 率 向 上 に 重 要 で あ り ， バ イ オ マ ー カ ー を 利 用 し た 疾 病 の 存 在 や 進 行 度 を 調 べ る 検 査 が 広 く 用 い ら れ て い る ． 現 行 法 と し て は ， 酵 素 結 合 免 疫 検 定 法 （ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法 ） に よ る バ イ オ マ ー カ ー の 計 測 が 主 流 で あ る が ， 同 手 法 は 酵 素 や 蛍 光 で 標 識 さ れ た 検 体 が 必 要 で あ る こ と や 測 定 に 多 段 階 の 工 程 が 必 要 で あ る こ と 等 の 問 題 点 を 有 し て い る ． 上 記 の 問 題 点 を 解 決 す る 計 測 手 段 と し て ， 標 識 分 子 を 利 用 し な い ラ ベ ル フ リ ー 検 出 を 可 能 と す る 電 界 効 果 ト ラ ン ジ ス タ （ Ｆ ｉ ｅ ｌ ｄ Ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｉ ｓ ｔ ｏ ｒ ； Ｆ Ｅ Ｔ ） バ イ オ セ ン サ が 注 目 さ れ て お り ， そ の 研 究 開 発 が 積 極 的 に 試 み ら れ て い る ． 近 年 で は ， 溶 液 中 で 安 定 作 動 す る Ｆ Ｅ Ｔ デ バ イ ス の 開 発 技 術 も 確 立 さ れ て き て お り ， 健 康 医 療 分 野 等 様 々 な 分 野 へ の 応 用 が 期 待 さ れ て い る ． Ｆ Ｅ Ｔ デ バ イ ス は 半 導 体 製 造 技 術 を 駆 使 し た 大 量 生 産 や 小 型 集 積 化 に 適 し て お り ， 普 及 時 に は コ ス ト や 汎 用 性 に お け る 優 位 性 を 持 つ と 考 え ら れ る ． Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン サ は ， 反 応 検 出 場 で あ る ゲ ー ト 表 面 上 に 特 異 的 に 捕 捉 さ れ る タ ー ゲ ッ ト 分 子 が 有 す る 電 荷 量 を ゲ ー ト に 印 加 す る 電 圧 の 変 化 量 （ ΔＶｇ） と し て 検 出 す る デ バ イ ス で あ る ． Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン サ は 考 案 さ れ て 以 後 ， そ の 実 用 化 の た め の 検 討 が 広 く 行 わ れ て き た が ， Ｄ Ｎ Ａ シ ー ケ ン サ ー と し て の 実 用 化 は な さ れ た も の の ， 未 だ 本 格 的 な 実 用 化 に 至 っ て い な い ． 実 用 化 に 向 け て の 課 題 を 解 決 し ， 新 た な バ イ オ セ ン サ の 産 業 化 へ の ト リ ガ ー と な る 研 究 開 発 が 望 ま れ る と こ ろ で あ る ． 本 論 文 で は ， Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン サ の 研 究 開 発 と し て ， バ イ オ マ ー カ ー の 検 出 高 感 度 化 及 び マ ル チ 検 出 に 向 け た 検 討 を 基 礎 か ら 応 用 に つ な が る 研 究 を 進 め て い る ．

本 論 文 は 全 四 章 か ら 構 成 さ れ て い る ． 以 下 に そ の 概 要 と 評 価 を 示 す ． 第 一 章 で は ， バ イ オ セ ン サ に 対 す る 社 会 的 ニ ー ズ 、 及 び Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン サ の 問 題 点 と そ れ ら に 対 応 し た 先 行 研 究 を 俯 瞰 し ， 本 博 士 論 文 研 究 の 目 的 を 述 べ て い る ．

第 二 章 で は ， バ イ オ マ ー カ ー の 中 で も 腫 瘍 マ ー カ ー と 免 疫 グ ロ ブ リ ン の 高 感 度 検 出 を ， 分 子 サ イ ズ の 小 さ い ２ 種 類 の プ ロ ー ブ 分 子 を 選 定 す る こ と で 実 現 し て い る ． バ イ オ マ ー カ ー は 血 液 や 体 液 中 に 極 微 量 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ て お り ， 臨 床 診 断 の 際 は 低 濃 度 ま で 検 出 で き る Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン サ の 開 発 が 望 ま れ る ． Ｆ Ｅ Ｔ に よ る 電 荷 変 化 の 検 出 領 域 は ゲ ー ト 界 面 の ご く 近 傍 に 制 限 さ れ ， セ ン シ ン グ 界 面 の デ バ イ 長 （ 電 気 二 重 層 の 幅 ） が 関 係 し て い る こ と に 着 目 し ， Ｆ Ｅ Ｔ セ ン シ ン グ の 高 感 度 化 に 有 用 で あ る 小 型 プ ロ ー ブ の 探 索 を 行 っ て い る ． 申 請 者 は プ ロ ー ブ と し て ， バ イ オ セ ン サ の 一 般 的 な プ ロ ー ブ で あ る 抗 体 （ 大 き さ ４ ～ １ ４ ｎ ｍ ） と 比 較 し て ， サ イ ズ の 小 さ い 抗 原 （ 大 き さ ４ ～ ７ ｎ ｍ ）お よ び 抗 原 結 合 性 フ ラ グ メ ン ト（ 大 き さ ２ ～ ３ ｎ ｍ ）を 選 択 し ， 特 に ア レ ル ギ ー 診 断 お よ び が ん 診 断 へ の Ｆ Ｅ Ｔ セ ン サ の 応 用 可 能 性 を そ れ ぞ れ 確 か め て い る ． ２ ． １ 節 で は ， 卵 白 ア ル ブ ミ ン （ ｏ ｖ ａ ｌ ｂ ｕ ｍ ｉ ｎ ； Ｏ Ｖ Ａ ） 抗 原 を セ ン サ 表 面 に 固 定 化 す る こ と で ， 卵 ア レ ル ギ ー の 患 者 が 保 有 す る 免 疫 グ ロ ブ リ ン Ｅ（ Ａ ｎ ｔ ⅰ － Ｏ Ｖ Ａ Ｉ ｇ Ｅ ）を 検 出 し て い る ．同 抗 原

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を プ ロ ー ブ と し て 用 い る こ と で ， 抗 体 を 用 い た 場 合 と 比 較 し て よ り 高 感 度 な セ ン サ 応 答 を 得 ， ま た 血 中 に 存 在 す る タ ン パ ク 質 （ ヒ ト 血 清 ア ル ブ ミ ン ） の 非 特 異 吸 着 の 抑 制 も 効 果 的 に 行 わ れ る こ と を 示 し て い る ． さ ら に ， Ａ ｎ ｔ ⅰ

－ Ｏ Ｖ Ａ Ｉ ｇ Ｅ 濃 度 を 変 化 さ せ て 測 定 を 行 な っ た 結 果 ， Ａ ｎ ｔ ⅰ － Ｏ Ｖ Ａ Ｉ ｇ Ｅ 濃 度 の 増 加 に 伴 い ト ラ ン ジ ス タ 特 性 で あ る ゲ ー ト 電 圧 シ フ ト ΔＶｇが 正 方 向 と な る 傾 向 が 見 ら れ ， そ の 結 果 ， Ａ ｎ ｔ ⅰ － Ｏ Ｖ Ａ Ｉ ｇ Ｅ を １ ｎ ｇ ／ ｍ Ｌ か ら １ ０ ０ ｎ ｇ ／ ｍ Ｌ の 範 囲 で 定 量 的 に 検 出 可 能 で あ る こ と を 明 ら か に し て い る ． こ の こ と は ， サ イ ズ の 小 さ い 抗 原 で は 高 感 度 な セ ン シ ン グ が 実 現 で き る こ と を 証 明 し て お り 、 学 問 的 に 有 効 な 成 果 を 挙 げ て い る 。

ま た ２ ． ２ 節 で は ， 抗 体 断 片 で あ る 抗 原 結 合 性 フ ラ グ メ ン ト （ Ｆ ａ ｂ ） を プ ロ ー ブ と し て 用 い る こ と で ， 肝 臓 が ん の 腫 瘍 マ ー カ ー で あ る α フ ェ ト プ ロ テ イ ン （ Ａ Ｆ Ｐ ） の 高 感 度 検 出 を 試 み て い る ． さ ら に ， 同 セ ン サ の ポ イ ン ト オ ブ ケ ア 検 査 と し て の 利 用 を 考 え た 時 に 重 要 と な る 血 清 中 に 存 在 す る 腫 瘍 マ ー カ ー 検 出 に 向 け て ， 血 清 成 分 タ ン パ ク 質 の 非 特 異 的 吸 着 を 効 果 的 に 抑 制 す る 検 討 を 行 っ て い る ． 申 請 者 は ， Ｆ ａ ｂ を 固 定 化 し た セ ン サ 表 面 へ の 非 特 異 的 吸 着 を 抑 え る た め に ， エ タ ノ ー ル ア ミ ン を 用 い る 抑 制 処 理 が 一 般 的 に 用 い ら れ る ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン を 用 い る 処 理 よ り も 効 果 的 で あ る こ と を 実 験 的 に 示 し て い る 。 す な わ ち ， 分 子 サ イ ズ の 小 さ い プ ロ ー ブ 固 定 化 表 面 に 対 す る ブ ロ ッ キ ン グ 処 理 に は ， 非 特 異 的 吸 着 を 抑 え る と 同 時 に ， プ ロ ー ブ の タ ー ゲ ッ ト 捕 捉 能 を 維 持 で き る 試 薬 を 選 定 す る こ と が 重 要 で あ る こ と を 見 出 し て お り ， 工 学 的 に 有 意 義 な 成 果 を み い だ し て い る ． こ の ブ ロ ッ キ ン グ 処 理 を 行 っ た Ｆ ａ ｂ 固 定 化 Ｆ Ｅ Ｔ セ ン サ を 用 い る こ と で ， 血 清 中 に 存 在 す る Ａ Ｆ Ｐ を カ ッ ト オ フ 値 （ １ ０ ｎ ｇ ／ ｍ Ｌ ） を 下 回 る 高 感 度 な 濃 度 ま で 検 出 可 能 で あ る こ と を 示 し て い る ． こ れ ら の 結 果 は ， Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン シ ン グ の 高 感 度 化 の た め に は ，抗 原 や Ｆ ａ ｂ と い う 分 子 サ イ ズ の 小 さ い プ ロ ー ブ を 用 い る こ と に よ り ， Ｆ Ｅ Ｔ 検 出 に お け る 電 荷 検 出 領 域 を 効 果 的 に 活 用 す る こ と が 有 用 で あ る こ と を 示 し ， 高 感 度 検 出 が 求 め ら れ る 臨 床 現 場 で の 実 用 化 に お い て 重 要 な 知 見 を 引 き 出 し て お り ， 工 学 的 に 高 く 評 価 で き る ．

第 三 章 で は ， バ イ オ マ ー カ ー の マ ル チ 検 出 に 向 け て ， １ チ ッ プ に 二 種 類 の 抗 体 を 固 定 化 し て ， 二 種 類 の バ イ オ マ ー カ ー を 一 度 に 検 出 す る 方 法 を 提 案 し て い る ． 申 請 者 は ， 肺 が ん が 非 小 細 胞 が ん （ Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ ） と 小 細 胞 が ん （ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ ） に 分 類 さ れ ， そ の 種 類 に よ っ て 治 療 法 が 異 な る こ と に 着 目 し ， 肺 が ん の 種 類 識 別 に 向 け て ， 上 記 の 腫 瘍 マ ー カ ー で あ る Ｃ Ｙ Ｆ Ｒ Ａ ２ １ － １ お よ び Ｎ Ｓ Ｅ の マ ル チ Ｆ Ｅ Ｔ 検 出 の 可 能 性 を 確 か め て い る ． 抗 体 固 定 化 時 に ２ 種 類 の 抗 体 溶 液 が 混 在 し な い よ う に 固 定 化 条 件 を 工 夫 し ， マ ル チ ア ナ ラ イ ト Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン サ を 作 製 し て い る ． そ の 結 果 ， 作 製 し た セ ン サ は Ｃ Ｙ Ｆ Ｒ Ａ ２ １ － １ と Ｎ Ｓ Ｅ に 対 し て 高 い 選 択 性 を 有 し て い る こ と が 示 さ れ ， 同 セ ン サ の 肺 が ん の 識 別 診 断 へ の 同 時 測 定 マ ル チ セ ン シ ン グ の 可 能 性 を 示 し て い る ． Ｆ Ｅ Ｔ は 半 導 体 製 造 技 術 を 用 い る こ と で 容 易 に 集 積 化 が 可 能 で あ る た め ， 将

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来 的 に は 数 百 個 以 上 の セ ン シ ン グ 部 の 集 積 化 に よ り ， 多 種 多 様 な バ イ オ マ ー カ ー の 同 時 検 出 実 現 を 示 唆 す る も の で あ り ， Ｆ Ｅ Ｔ セ ン サ の 実 用 化 に 向 け た 研 究 開 発 の 第 一 歩 と し て 工 学 的 意 義 が 高 い 成 果 と 評 価 で き る ．

第 四 章 は 第 二 章 と 第 三 章 で 得 た 研 究 成 果 ， 知 見 を 総 括 し て い る ．

以 上 ， 本 論 文 は Ｆ Ｅ Ｔ を ベ ー ス に し た バ イ オ マ ー カ ー の 高 感 度 検 出 を 可 能 に し ， か つ ， 血 清 中 に 存 在 す る バ イ オ マ ー カ ー の マ ル チ 検 出 を 可 能 に し て い る ． こ の よ う に ， 基 礎 的 な 検 討 か ら 工 学 的 な 視 点 に 立 っ た 次 世 代 バ イ オ セ ン サ の 開 発 指 針 を ま と め て い る た め ， 健 康 医 療 分 野 で 重 要 で あ る バ イ オ マ ー カ ー 検 出 用 Ｆ Ｅ Ｔ バ イ オ セ ン シ ン グ の こ れ か ら の 可 能 性 を 新 た に 開 い て お り ， 今 後 の バ イ オ セ ン サ 分 野 に 大 き く 貢 献 す る も の と 高 く 評 価 で き る ．

よ っ て ， 本 論 文 は 博 士 （ 工 学 ） の 論 文 と し て 相 応 し い も の と 認 め る ．

２ ０ １ ５ 年 ７ 月

審 査 員 （ 主 査 ） 早 稲 田 大 学 教 授 工 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 逢 坂 哲 彌

早 稲 田 大 学 教 授 工 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ） 菅 原 義 之

早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 工 学 ） 早 稲 田 大 学 本 間 敬 之

早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 工 学 ） 早 稲 田 大 学 門 間 聰 之

早 稲 田 大 学 教 授 博 士 （ 理 学 ） 北 海 道 大 学 中 西 卓 也