博士（獣医学）中山絵里 学位論文題名
Specificity and function of filovirus glycoprotein‑specific antibodies
（フイロウイルス表面糖蛋白質に対する抗体の特異性およぴ機能に関する研究）
学位論文内容の要旨
フイ口ウイルスは進化系統学的にエポラウイルス5種およびマールプルグ ウイルス1種に分類され、いずれも霊長類に重篤な出血熱を引き起こす。フイ 口ウイルスの自然宿主および感染経路は不明で、効果的なワクチンや治療法も 未だ確立されていない。これまでに開発された抗体検出ELISA法では主に核蛋 白質(NP)が抗原 として使用 されている が、NPに対す る抗体はウ イルス種間 で交叉反応性が高く、各ウイルス種に対する特異抗体を区別することが困難で ある。第一 章では、ウ イルス種に よって抗原性の異なる表面糖蛋白質（GP) を抗原に用い、感染ウイルス種の特定が可能な抗体検出ELISA法を確立するこ とを目的とした。
GPの膜貫通領域と細胞質内領域を欠失させ、ヒスチジンタグを付加した 分泌型組換えGPを発現するプラスミドを構築し、これを導入した培養細胞の 上清からニッケルピーズカラムで組換えGPを精製した。精製した組換えGPを ELISA抗原とし、マウスの免疫血清、実験感染サル血清、患者血清中の特異抗 体の検出を試みたところ、各ウイルス種に対するIgG抗体を種特異的に検出可 能であった。また、これまでのELISA法では検出困難だったIgM抗体が急性期 患者血清から種特異的に検出可能であった。フイ口ウイルス感染初期にはGP が血液中に大量に放出されることから、ウイルス粒子内部に存在するNPに比 ベ、GPはB細胞に容易に認識されうるため、患者血清中のIgM抗体を検出可能 であったと考えられた。
第二章では、フイ口ウイルスのGPに対する抗体の機能と病原性に関する 研究を行った。エポラウイルスのGPに対する抗体の中には、中和抗体だけで なく、ウイルスの感染性を増強させる抗体が存在することが分かっている。本 研究では、マールプルグウイルスにおけるこの抗体依存性感染増強現象(ADE) と病原性との関係を解明することを目的とした。
病原性の異なるマールプルグウイルス、Angola株とMusoke株のGPに対す る免疫血清およびモノク口ーナル抗体を作出し、水胞性ロ炎ウイルスの表面糖 蛋白質をAngola株およびMusoke株のGPに置換したシュードタイプウイルスを 用いた中和試験および感染増強試験を実施した。Angola株およびMusoke株の
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間で、免疫血清の中和活性および中和抗体ク口ーンの誘導能には差はみられな か ったが、マールプルグウイルスの中で最も病原性が高いと考えられている
Angola株に 対する 免疫 血清 およびモノク口ーナル抗体でADE 活性は顕著に認 められた。これらの結果から、マールプルグウイルスの病原性発現にADE が関 与 する可能性が示唆された。さらに、Angola 株とMusoke 株GP のキメラ体、欠 失 変異 体お よび点 変異 体を 作出し、ADE に関与するGP 分子上の領域を探索し た 。そ の結 果、ADE 抗体の エピ トープはAngola 株GP 上の糖鎖に富むムチン様 領 域内 に多 く存在 する こと およびAngola 株とMusoke 株のADE 活性の違いは、
膜 融合を担うGP2 領域内の547 番目のアミノ酸の違いによって決定されること が明らかとなった。マールプルグウイルスが宿主因子のC 型レクチンを介して 細胞へ吸着した場合、エンドサイトーシスによる細胞への侵入または膜融合の ス テップで、547 番目のアミノ酸が重要であることが示されており、ADE を介 し た感 染時 にも、 この アミ ノ酸が 重要 な役 割を 担って いる と考えられた。
本 研究 で開発 した
ELISA法 は各フイ口ウイルス種に対する抗体を特異的 に検出可能であったことから、確定診断のための有用な情報を提供すると考え られる。また、本法はフイロウイルス感染症の血清疫学調査を行う際の有効な 手 法となる。さらに、本研究でGP に対する抗体の一部がマールプルグウイル スの感染を増強する現象を見出し、ワクチン開発のための重要な知見を提供し た。これらの成果は、フイロウイルスの生態解明および本ウイルス感染症の予 防・治療法の開発に大きく貢献すると期待される。
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学位論文審査の要旨 主査 副査
副査 副査
教授 教授 教授 准教授
高田 鈴木 澤 苅和
学 位 論 文 題 名
礼人 定彦 洋文 宏明
Specificity and funCtionof丘 10ViruSglyCOprotein‐ SpeCi丘 C antibodieS
（フ イロウイ ルス表面 糖蛋白質 に対する抗体の特異性およぴ機能に関する研究）
フ イ 口 ウイ ル スは 進 化 系統 学的にエポ ラウイル ス（5種） およびマ ールプル グ ウ イル ス （1種） に 分 けら れ る。これま でに開発 された抗 体検出法 では、主 に核 蛋白質(NP)が抗原と して使用 されている が、NPに対 する抗体 はウイル ス種間で交 叉反応 性が高く 、各ウイ ルス種に対 する特異 抗体を区 別できな い。第一 章では、
フイロ ウイルス の唯一の 表面蛋白質 で、ウイ ルス種に よってア ミノ酸配 列の相同 性 の 低 い 表 面 糖 蛋 白 質(GP)を 用 い 、 感 染ウ イ ルス 種 の 特定 が 可能 な 抗 体検 出 ELISA法を確 立した。
GPの膜貫 通領域と 細胞質内 領域を欠失 させ、ヒ スチジン タグを付 加した分 泌型 組換えGPを発現す るプラス ミドを構築 し、これ を導入し た培養細 胞の上清 からニ ッ ケル ピ ーズ カ ラ ムで 組 換 えGPを精 製 し た。 精 製し た 組換 えGPを抗原 とし、マ ウス免 疫血清、 実験感染 サル血清、 患者血清 中の特異 抗体を検 出したと ころ、ウ イルス 種特異的IgG抗体が高 感度で検出 可能であ った。ま た、IgM抗体 も急性期患 者 血清 か ら種 特 異 的に 検 出 可能であっ た。本研 究で開発 したELISA法は 、フイロ ウ イ ル ス 感 染 症 の 診 断 お よ び 疫 学 調 査 に 活 用 で き る と 考 え ら れ る 。 第2章 で は、GPに対 す る 抗体の 機能と病原 性に関す る研究を 行った。 工ポラウ イルス のGPに対す る抗体の 中には、中 和抗体だ けでなく 、ウイル スの感染 性を増 強する 抗体が存 在するこ とが分かっ ている。 本研究で は、マー ルプルグ ウイルス に お け る こ の 抗 体依 存 性感 染 増 強現 象(ADE)と 病原 性 と の関 連 を解 析 し た。 病 原 性の 異 なる マ ー ルブ ル グ ウイ ル ス、Angola株お よ びMusoke株のGPに対 するマ ウス免 疫血清お よびモノ クローナル 抗体を作 出し、水 胞性ロ炎 ウイルス の表面糖 蛋 白質 を マー ル プ ルグ ウ イ ルス のAngola株 お よびMusoke株のGPに置換し たシュ ー ドタ イ プウ イ ル スを 用 い た中和試験 およびADE試 験を行っ た。Angola株お よび Musoke株の間 で、免疫 血清の中 和活性およ び中和抗 体ク口ー ンの誘導 能には差は み られ な かっ た が 、ADE活 性は 、Angola株GPに対す る抗体に のみ顕著 に認めら れ た 。こ の 結果 か ら 、ADE抗 体誘 導能はAngola株お よびMusoke株の 病原性の 違いと 相 関し て おり 、 マ ール ブ ル グウイルス の病原性 発現にADEが 関与して いる可能 性
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が示唆された。
本研究では、フイ口ウイルス粒子がもつ唯一の表面蛋白質であるGP に対する抗 体の特異性に着目し、感染したウイルス種を特定する抗体検出法を確立した。さ らに、これらのGP に対する抗体の一部がマールプルグウイルスの感染を増強する 現象を見出し、病原性発現への関与を示唆した。これらの成果は、フイロウイル スの生態解明および予防・治療法開発におおいに貢献すると考えられる。よって 審査委員一同は、上記論文提出者、中山絵里氏が博士（獣医学）の学位を授与さ れるに十分な資格を有するものと認めた。
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