博士（医学）坊垣 学位論文題名
幸
The p38 mitogen‑activated protein kinase (MAPK) pathway mediates induction of the tissue factor gene in monocytes stimulated with human monoclonal anti‑,B2 Glycoprotein I antibodies
（ヒ ト モ ノク ロ ー ナル 抗f32グ リ コ プロ テ インI抗 体 刺 激に お ける p38 MAPK経 路 に よ る 組 織 因 子 産 生 に 関 す る 研 究 ）
学位論文内容の要旨
抗 リン脂質 抗体症候 群（Antiphospholipid syndrome：以下APS）は、02グリコプロ テインI（以下f32GPI）依存性抗カルジオリピン抗体（以下抗CL／P2GPI抗体）、ループ スアンチコアグラントなどの抗1」ン脂質抗体と総称される一群の自己抗体が引き起こす 自己免疫性血栓性疾患である。抗リン脂質抗体が血管内皮細胞や単球系細胞に直接作用 し、凝固のイニシエーターである組織因子（tissue factor：以下TF）を細胞表面に発現 することにより凝固系を活性化することにより、易血栓性が誘導されることが知られて い る。しかし、抗体が対応抗原であるP2GPIやプ口トロンピン等のりン脂質に結合した 凝固・線溶を制御するタンバクに結合した後の細胞刺激シグナルについては明らかにさ れていない点が多い。
今回、我々は、抗ルン脂質抗体による細胞刺激シグナル、細胞活性化メカニズムにつ い て 検 討 を 行 う こ と に よ り APS発 症 機 構 を 解 明 す る こ と を 目 的 と し た 。 末梢血単核球および単球系細胞株を用いて、APS患者の末梢血リンパ球より樹立した ヒ ト モノクロ ーナルIgM型 抗CL/P2GPl抗体（EY2C9） により刺 激し、検 討を行っ た。
遺 伝子発現 の挙動に ついては 、ヒト末梢血単核球を用いて、cDNAアレイおよびりアル タ イ ムPCR法 に より 検 討 を行 っ た。 その結果 をふまえ て、単球 系細胞株RAW264.7を 用 い て抗CL/P2GPI抗体 刺激によ るMAPK経路のル ン酸化に ついてウ エスタン プ口ッテ イング法で検討した。
cDNAア レ イ およ び1」 アル タ イ ムPCR法 によ る 遺 伝子 発 現解 析 より、MAPK経路が抗 CL/p2GPI抗 体刺激に よるTF発現に関わっていることが示唆された。さらに、ウエスタ ンプ口ッテイング法での解析にて、抗C L/P2G Pl抗体による細胞刺激により、p38 MAPK の りン酸化およびNFKBの核内移行が認められた。また、特異的p38阻害薬（SB203580） に て 抗CL/132GPI抗体 刺 激 によ るp38 MAPKリン 酸 化 が阻 害 され 、リア ルタイムPCR 法 に お いてTF発 現 の 抑制 も 確 認さ れ た。 ま た 、抗CL/P2GPI抗 体によるp38 MAPKリ ン 酸化は、P2GPIの非存在下では認められなかった。さらに、遺伝子発現解析の結果か ら 、TNFa、IL‑ipなど の炎症性 サイトカ インやケモ カインの発現亢進が認められた。
p38MAPK経 路 は、 抗 ルン 脂 質 抗体 刺激に よる単球 からのTF発 現に重要 な役割を 果た し て いると考 えられた 。抗CL／P2GPI抗体 による刺 激によりp38MAPKのりン酸 化に引
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き 続 き、NFKBが核内 へと移行し 、TFプ口モ ーターに 結合し、TF転写が誘 導されて く る可能性が考えられる。これまでの研究から、抗ルン脂質抗体症候群患者由来のモノク 口ー ナル抗I32GPI抗体は、培養内皮細胞に接着因子（ICAM‑I、VCAM‑I、E‑セレクチン1 の発 現を誘導し、さらにモノクローナル抗P2GPI抗体は、単球や内皮細胞にも外因系凝 固 反 応の ト ルガ ー で あるTFのmRNAや 蛋白 を誘導す ることが 示されて いる。p38MAPK 阻害 によりTF発 現が抑制 されると いう今回の 研究の結 果より、p38MAPK経路の制御は APS患者 の血栓向 性に対す る新たな 治療法と成 り得る可 能性が考えられる。また、抗 CL/P2GPI抗体 によるTFの 発現はP2GPIが 存在して いるときに のみ認められ、単球の細 胞活性化はP2GPIに依存する、すなわち細胞とP2GPIに結合した自己抗体とのinteraction によ るものであると考えられる。P2GPIはいわばアンカーとして存在しており、受容体 分 子 や 共 役 分 子 の 存 在 が 想 定 さ れ 、 今 後 そ の 分 子 の 同 定 が 必 要 で あ る 。 TFを中 心にした 向凝固性 の蛋白誘 導の細胞内刺激伝達システムをより詳細に解析する こと により、APS発症のメ カニズム を解明するのみならず、難治性であるAPSの新しい 治 療 法の 確 立が 期 待 され る 。p38MAPK経 路 の制 御 に よるTF発 現 の 制御は 、APSの血 栓向性にたいする特異的な治療のーつとなる可能性がある。
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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 畠 山 鎮 次 副 査 教 授 小 池 隆 夫 副 査 教 授 今 村 雅 寛
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論 文 題 名
The p38 mitogen‑activated protein kinase (MAPK) pathway mediates induction of the tissue factor gene in monocytes stimulated with human monoclonal anti‑B2 Glycoprotein I antibodies（ヒトモノク．ローナル抗グ2 グリコプロテインI 抗体刺激における
p38 MAPK経 路 に よ る 組 織 因 子 産 生 に 関 す る 研 究 ）
抗リン脂質抗体症候群(Antiphospholipid syndrome：以下APS)は、眺グリコプロテイン 1（以下P2GPI)依存性抗カルジオリピン抗体（以下抗CU[32GPI抗体）、ループスアンチコ アグラントなどの抗リン脂質抗体と総称される一群の自己抗体が引き起こす自己免疫性血 栓性疾患である。抗リン脂質抗体が血管内皮細胞や単球系細胞に直接作用し、凝固のイニ シエーターである組織因子(tissue factor：以下TF)を細胞表面に発現することにより凝固 系を活性化することにより、易血栓性が誘導されることが知られている。しかし、抗体が 対応抗原であるP2GPIやプロトロンピン等のりン脂質に結合した凝固・線溶を制御するタ ンバクに結合した後の細胞刺激シグナルについては明らかにされていない点が多い。本研 究では、抗リン脂質抗体による細胞刺激シグナル、細胞活性化メカニズムについて検討を 行うことによりAPS発症機構を解明することを目的とした。
末梢血単核球および単球系細胞株を用いて、APS患者の末梢血リンパ球より樹立したヒ ト モ ノ クロ ー ナ ルIgM型抗CUp2GPI抗 体(EY2C9)に より 刺激し、 検討を 行った。 遺伝 子 発現の挙動については、ヒト末梢血単核球を用いて、cDNAアレイおよびりアルタイム PCR法によ り検討を 行った 。その結 果をふ まえて、 単球系 細胞株RAW264.7を用いて抗 CUP2GPI抗体刺 激によ るMAPK経路の りン酸 化につい てウェ スタンブ ロッテ イング法で 検 討した。cDNAアレイ およびり アルタ イムPCR法による 遺伝子 発現解析 より、MAPK経 路 が抗CUP2GPI抗体刺 激によるTF発現に関わっていることが示唆された。さらに、ウェ スタンブロッティング法での解析にて、抗CUI3zGPI抗体による細胞刺激により、p38 MAPK の ルン酸化 およびNFKBの核内移 行が認 められた 。また、 特異的p38阻害 薬(SB203580) に て 抗CUP2GPI抗 体刺 激に よるp38 MAPKリ ン酸化 が阻害さ れ、リア ルタイ ムPCR法 に おいてTF発現の抑制も確認された。また、抗CL/132G PI抗体によるp38 MAPKリン酸化は、
t32GPlの非存在下では認められなかった。さらに、遺伝子発現解析の結果から、TNFa、IL―ip な どの炎症性サイトカインやケモカインの発現亢進が認められた。p38 MAPK経路は、抗 リ ン脂質抗体刺激による単球からのTF発現に重要な役割を果たしていると考えられた。
抗CUI32GPI抗体に よる刺激 によりp3 8MAPKのりン酸 化に引き続き、NFKBが核内へと移 行 し 、TFプ 口 モー タ ー に結 合 し 、TF転 写が 誘 導 され て く る 可能 性 が 考え ら れた。
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これまでの研究から、抗リン脂質抗体症候群患者由来のモノク口ーナル抗p2GPI抗体は、
培養内皮細胞に接着因子(ICAM‑I、VCAM‑1、E‐セレクチン）の発現を誘導し、さらにモノ ク口ーナ ル抗P2GPI抗体は 、単球や内皮細胞にも外因系凝固反応のトリガーであるTFの mRNAや蛋 白 を 誘導 す るこ とが示 されてい る。p38 MAPK阻 害によ りTF発現が 抑制さ れ るという 今回の 研究の結 果より、p38 MAPK経路の制御はAPS患者の血栓向性に対する新 たな治療 法と成 り得る可 能性が考 えられ た。また 、抗CUPzGPI抗体に よるTFの 発現は P2GPIが存在しているときにのみ認められ、単球の細胞活性化はP2GPIに依存する、すなわ ち細胞とP2GPIに 結合した 自己抗 体とのinteractionによるものであると考えられた。
質疑応答では、副査今村教授から、単球系細胞ではなく血管内皮細胞でも同様の結果が 得られるか、他の凝固促進物質における組織因子発現とp38 MAPK経路との関連について、
抗リン脂質抗体症候群の治療ヘ応用するためのp38 MAPK経路に関わるより特異的な因子 の有無についての質問があった。次いで主査畠山教授から、刺激抗体はIgM抗体であるこ とが必須条件であるか、RNAレベルでの発現の差のタンバクレベルでの確認について、抗 体刺激によるp38 MAPK発現亢進の有無にっいて、分泌型夕ンバクであるI32GPIが細胞に 刺激を伝える機序についての質問があった。次いで副査小池教授から、研究成果を踏まえ て今後の臨床応用への展望についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は 概ね適切に回答した。
この論文 は、APSの易血 栓性の 誘因とな るTFの発 現にp38 MAPK経 路が関わ ることを 初めて明らかにした点で高く評価され、本論文の成果から今後のAPSの病態解明と新しい 治療開発が期待される。
審査委員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位など も併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。
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