博士（医学）岩崎 博 学位論文題名

     博士（医学）岩崎   博    学位論文題名

CD7 陽性白血病細胞の細胞生物学的特性に関する研究

―樹 立せるHSM 911株化 細胞による検討一

学位論文内容の要旨

目的

  白 血 病 は 未 熟 な 造血 前 駆 細 胞 レ ベ ル で の腫 瘍化と 考え られ てい る．最 近，T細 胞 に 特 徴 的 と 考 え ら れ て き たCD7を 表 現 し て い るCD7陽 性 急 性 白 血 病と い う 亜 型 が 報 告 さ れ ， リ ンパ 球 系 と 骨 髄 球 系 と に 分 化す る 以 前 の 未 熟 な 多 能 性 幹細胞 の 腫 瘍 化 で ， 化 学 療 法 に 抵 抗 性 と さ れ て い る ．CD7陽 性 白 血 病 細 胞 株 に 関 す る 報 告 は わ ず か に 散 見 さ れ る の み で ， 詳 細 な 検 討 は 認 め ら れ て いな い ． 今 回 ， 私 tま 急 性 骨 髄 性 白 血 病(AML)の 患 者 よ り CD7陽 性 白 血 病 細 胞 株 を 樹 立 し ， CD7陽 性 白 血 病 細 胞 の 特 徴 を 明 ら か に す る た め に ， そ の 細 胞 生 物 学 的 特 性 ， 抗 癌 剤 に対 す る 反 応 性 な ど を 検 討 した ．

材 料 と 方 法

1．患者

  1986年発 症のAML( Ml）の2回 目の 再発 と診断され，1990年7月，当科に入院した．

自 血 病細 胞 は べ ル オ キ シダ ーゼ 染色 陽性で ，表 面形 質ではCD2，CD13．CD33が認 め られた．

2．細胞株の樹立

  1991年1月14日 の 末 梢 血 （ 白 血 球数6，900/,u1， 白 血病 細胞90%）よ り比 重遠 沈 法 に よ ヮ て 単 核 球 を 分 離 し ，20%FBS加Iscove smodified Dulbecco Smedium

（IMDM)と 種 々 の サイ ト カ イ ン と を 加 え て 培 養し た.GMーCSFで 培 養 し て い た細 胞 より．細胞株が得られHSM911と命名した．

3．細胞学的特徴

  （1）細胞化学：メイギムザ（MG)，periodic―acld Shiff（PAS），ペルオキシダー ゼ（PO）， ズダ ンブ ラッ クB（SBB)，a−naphthyl butyrate est,erase（ロ−NBE)，

naphthol AS―Dchloroacetate esterase（NACE)染色を施行した．

  (2)細 胞 表 面 マ ー カ ー ：FACScanに て 検 討 し た ． モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 はOKT6

（CD1），OKT11（CD2)，OKT3( CD3)，OKT4（CD4)，Leul（CD5)，T55( CD7)，OKT8（CD8)，J5

（CD10)，My7（CD13)，My4（CD14)，B4（CD19)，Bl（CD20)，My9（CD33），HPCA−1（CD34），

0KT10（CD38），0KIal（HLAーDR），抗GPnb/／皿a抗体（CD41a），17Fll（抗C―たff抗体），

抗VLAl〜VLA5抗 体 ，BBA3（ 抗ICAMl抗 体 ） ，SPV―L7（ 抗LFAl抗 体 ） ，Leu44（ 抗CD44抗 体），Leu8（抗LAMl抗体）を用いた・

  （3）T細 胞 受 容 体 （TCR） ， 免 疫 グ 口 ブ リ ン （Ig）遺 伝 子 再 構 成 の 検 討 ： 細 胞 よ り 高分子DNAを抽出後，サザンブ口ット法により解析した．

4．サイトカイン反応性の検討

  細 胞 増 殖 は3― （4，5−dimethylthiazol―2―y1） ―2，5ーdiphenyltetraZ01ium bromide（MTT） を 用 い て 検 討 し た ． リ コ ン ビ ナ 、 ン 卜 ヒ ト イ ン タ 一 口 イ キ ン −1

（rhIL―1），rhIL―2，rhIL―3，rhIL−4；rhIL−5，rhIL−6，顆粒球コロニーー刺激因子

（rhG−CSF） ， 顆 粒 球 ／ マ ク 口 フ ァ ー ジ コ 口 ニ 一 刺 激 因 子（rhGM―CSF） ，マ クロ ファ ー ジ コ ロ ニ 一 刺 激 因 子 （nhやCSF） ，StemCe11factor（rhSCF） ， エ リ ス 口 ポ エ チ ン （rhEpO） ， イ ン タ ー フ ェ ロ ン ー ア （IFN−r） ，tranSforminggrOWth士aCtor一 声

（TGF―ロ ）， ポリ クロ ーナ ノレ 抗ヒ トGM−CSF抗体 ，抗 ヒトG−CSF抗 体， 抗ヒ トIL−3抗 体を用いた．

5．サイトカインレセプターの検討

  （1）12゜IGM―CSF（ ま た は12゜IIL―3） を ，50倍 濃 度 のGM， −CSF（ また はIL−3） 存 在 下 ま た は 非 存 在 下 に 加 え て 培 養 後 ， シ リ コ ン オ イ ル に 重 層 ・ 遠 沈 し ， 上 清 ・ 細 胞をr−カウンターにて測定した・

  （2）fluoreSCeiniSOthiOCyanate（FITC） 標 識G−CSF，GM−CSF，IL一3を 用 し ヽ て FACScanにて検索した．

6．分化能の検討

    DimethylSulIOXide（DMSO） ，12―O―tetradeCanoylphorb0113―aCetate（TPA），

bovi．neheminChloride，CytOSinearabinOSide，G―CSF，M―CSF，IL−2を 添 加 し て 培 養 し た 後 種 々 の 染 色 を し ， 光 学 顕 微 鏡 に て 観 察 し た ． さ ら に ，GM−CSF存 在 下 に TPAを加え培養後，FACScanにて表面抗原の変化を検討した．

7．抗癌剤に対する反応

  細 胞 増 殖 に お よ ぽ す 抗 癌 剤 の 影 響 をMTT法 を 用 い て 検 討 し た ． 抗 癌 剤 は ， DaunorubiCin，DOXOrubiCin，MitOXantron，EtopOSide，CytOSinearabinOSide， Amethopterin，VindeSineを用しヽた・

結 果

1．細胞学的特徴

  lrtG染 色 では ， ほ ぼ円 形 で中 型 のN/C比 が 中等 度 の 細胞 と ，大 型で多核の 巨核球 様細 胞とが混在 していた．PAS，PO，SBB，ば―NBE，NACE染色は陰性で，GP且b／皿a染 色 て は 陽 性 細 胞 が 巨 核 球 様 細 胞 だ け で な く 中 型 の 細 胞 に も 認 め ら れ た ． 細 胞 表 面 マー カ ー では ， 患者 白 血病 細 胞で認めら れたCD2，CD13，CD33の他にCD7，CD34， CD38，CD41a，HLA―DRが 陽 性で ，TdT活性も陽性 であり，骨 髄球系だけ でなく，Tリ ン パ 球 系 ， 巨 核 球 系 の 形 質 を も 有 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た ．TCR，Ig geneは germ lineを 示 し た ． 接 着 因 子 発 現 は ， 検 討 し 得 た 接着 因 子は 全 て陽 性 であ っ た が，VLAJ̲，VLA2，VLA3の発現は低かった・

2．サイトカイン反応性

  MTT法 を 用 い た 細 胞増 殖 の検 討 では ，GM−CSF，IL−3及びSCFに 濃度 依 存 性に 増 殖 を 示 し た が ， 他の サ イト カ イ ンに は 反応 を 示さ ず ，GM‑CSF，IL−3あ る いはSCF との 相加・相乗 作用は認め られなかっ た．Glrt−CSF，IL―3による細胞増殖は，それ ぞ れ抗GNf−CSF抗体， 抗IL−3抗 体によって 濃度依存性 に阻害され たが，抗G−CSF抗 体 や異なる抗 体では阻害 されなかっ た．GM一CSF，IL−3，SCFの間で 相加・相乗 効果 は 認 め ら れ な か っ た ．TGF‑p，IFN‑ア は 濃 度 依 存 的 にHSM911のGlal‑CSF依 存性 増 殖を抑制した．

3．サイトカインレセプターの検討

  GM一CSF，IL−3の レ セプ タ ーはscatchard解析に より2相 性を示し， レセプタ一 数 解離定数（Kd)はGkt−CSFで高親和性約30個，lOpM，低親和性約1，900個，900pld，IL―3 で高 親和性約50個，40pM，低親和性 約1，6000個 ，1，900pMと考えられた．FACScanを 用い たレセプタ ーの検討で は，GM−CSF，IL−3レ セプターはGNI‑CSF，IL−3によって 発 現 の 低 下 を 認 め ，SCFに よ りIL―3レ セ プ タ ー の み そ の 発 現 が 低 下 し た ． 一 方 c‑kitは，SCFに よ り著 明 に発 現 の低 下 を，GM‑CSF，IL―3に よっ て若干の 抑制を認 めた．G―CSFレセプターはほとんど発現していなかった．

4．分化能

  TPAに よ りMG染 色 で 形 態 学 的 に は マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 細 胞 に 分 化 し た が ， ぱ‑NBE染色 陰 性で あ ヮた ． さら にTPA処 理に よ り，CD13，CD34，CD38の発現が 増加 しCD7が低下したが，CD14には変化が認められなかった．

5．抗癌剤に対する反応

  各 種 抗 癌 剤 に 対 し て は 濃 度 依 存 性 に 増 殖 抑 制 が 認 め ら れ た.AML(M1） 患 者 よ り 得 た 白 血 病 細 胞 とPhl陽 性 急 性 リ ン パ 性 白 血 病 （ALL)細 胞 株（HSPI931)を用 い て 比較 検 討 した が ，LD50はAk{L細胞の2‑‑‑1．O倍 以上であり ，HSM931とは薬剤に よ る感受性の差が認められたものの，HSM911の方が高かった．

考 案

  本 研 究 で 用 い た 細 胞株 は ，3系 統 に ま た が る 表 面形 質 を 発 現 し ，TCRの 再 構 成 を認めず，LFA1，LAMl，CD44，VLA4，VLA5が強陽性で，G一CSFレセプターを発現せず，

未 熟 な造 血 前 駆 細 胞 の 増 殖 を 刺 激するIL―3，GM‑CSF，SCFに反 応し ，比較 的成 熟 した 前駆細 胞の 増殖 を刺 激するG―CSF，M‑CSF，Epoには反応しないなどの点から，

幼 若 な 前 駆 細 胞 の 腫 瘍 化 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ． 本 細 胞 株 に お い て ， SCF処 理 に よ る IL― 3レ セ プ 夕 一 の 発 現 低 下 ， あ る い は GM― CSF・ IL−3処 理 に よ るSCFレ セ プ タ ー の 発 現 低 下 が 認 め ら れ た が ， シ グ ナ ル 伝 達 に お い て3者 と も チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ を 介 レ て い る こ と が 知 ら れ て お り ， レ セ プ タ ー 間 で の 何 ら か の 制 御 機 構 の 存 在 が 示 唆 さ れ る が ， そ の 詳 細 は 不 明 で あ る ． 抗 癌 剤 に 対 す る 反 応 性 は ， 新 鮮 AML細 胞 や 治 療 抵 抗 性 と さ れ る Phi陽 性ALL由 来 細 胞 株 と 比 較 し て 耐 性 を 示 し た ． 本 細 胞 株 は ，IFNT ‑ア ， TGF ‑ロ に よ っ て そ の 増 殖 が 濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ ， CD7陽 性 自 血 病 の 治 療 に こ れ ら の サ イ ト カ イ ン が 有 効 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．     結語

  GM‑ CSF，IL−3，SCFに 依 存 し て 増 殖 す るCD7陽 性 自 血 病 細 胞 株 を 樹 立 し ， 1． 多 能性 造 血 前 駆 細 胞 の 腫 瘍 化 と考 え ら れ た ．

2． 各 種抗 癌 剤 に 対 す る 反 応 性 が 悪く ， 臨 床 的 にCD7陽 性 白 血 病が 治 療 抵 抗 性 で あ る とす る 報 告 に 矛 盾 し な い こ と が示 唆 さ れ た ．

3.IFNーア に よ っ て 濃 度 依 存 的 に 増殖 が 抑 制 さ れ ，CD7陽 性 白 血病 のIFN‑ァ に よ る 治 療の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．

  以 上の 結 果 か ら ，CD7陽 性 白 血 病の 治 療 法 の みなら ず， 自血 病細 胞の増 殖と 分 化 と を検 討 す る 上 で 有 用 な 細 胞 株 と考 え ら れ た ．

学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

CD7 陽 性 白 血 病 細 胞 の 細 胞 生 物 学的 特 性 に関 す る 研 究

一 樹立 せるHSM 911株化細 胞による検 討一

    目的

  白血病は造血前駆細胞の腫瘍化と考えられている。最近、CD7陽性急性白血病 という亜型が報告され、多能性幹細胞の腫瘍化で、化学療法に抵抗性とされてい る。CD7陽性自血病細胞株の報告は少なく、詳細は検討されていない。本研究で は、CD7陽性自血病細胞の特徴を明らかにするために、急性骨髄性自血病（AbIL) 患者よ り樹立され たCD7陽性白血病細胞株の細胞生物学的特性を検討した。

    材料と方法

  1）患者：   AML（ Ml）の2回目の再発で、自血病細胞はペルオキシダーゼ・（PO)染色 陽性て、表面形質ではCD2、CD13、CD33陽性であった。

  2） 細 胞 株 の 樹 立 ： 末 梢 血 よ り 単 核 球 を 分 離 ・ 培 養 し 、GblーCSF'依 存 性 細 胞株 が樹立され、HSM911と命名した。

  3）細胞学的特徴：（1）細胞表面マーカ一：    FACS canにて測定した。(2)T細胞受 容 体 （TCR)、 免 疫 グ 口 ブ リ ン （Ig)遺 伝 子 再 構 成 の 検 討 ： 細 胞 よ り 高 分 子DNAを 抽出後、サザンブ口ット法により解析した。

4）細 胞 増殖 の検 討：bITT(3−（4，5一dimethylthiazol―2―yl）―2，5ーdiphenyl tetrazolium bromide)法 に て 測 定 し た 。 リ コ ン ビ ナン トヒ ト イン ター 口イ キン ―1

（thIL一1）、thIL‑2¥ thIL−3、thIL―4、thIL―5、thIL‑6顆粒球／マク ロファージ コ口ニ一刺激因子（thGhl−CSF)、rhG―CSF、nhAI一CSF、stem cell factor（rbSCF)、 工 リ ス ロ ポ ェ チ ン （thEpo） 、 イ ン タ ー フ ェ 口 ン ―r（IF．N一r） 、transforming growthfactor− 」8（TGF― 」8） 、Daunorubicin（DM） 、D0xorubicin（ADR） 、 Mitoxantron（Mit） 、Etoposide（ETP） 、Cytosinearabinoside（CA） 、 Amethopt￡rin（MTX）、Vindesine（VDS）を用L、た。

  5）サ イ トカ イン レセ プタ ー： （1）1251GM―CSF（ま たは12511L−3）を 、5畊 音濃 度 のGMーCSF（ ま た はILー3）存 在 下ま たは 非存 在下 に加 えて 培養 後、 シリ コン オイ ル に 重 層 ・ 遠 沈 し 、 上 清 ・ 細 胞 をrー カ ウ ン タ 一 （ ア 口 力 社 製 、 東 京 ） に て 測 定 し、scatchard解析 を行 った 。（2）fluoresceinisothiocyanate（FITC）標 識サ イト カインにて染色後、FACScanにて検討した。

保敬 光

『 査査 査 主副 副

6）分化能：Dimethrrlsulfoxide(DbISO)、12−0−tetradecanoyl phorbol 13− acetate(TPA)、bovine hemin chloride、CA、G―CSF'、MーCSF、ILー2と共に3H問 培養後、種々の染色を施行して検討した。

    結果

  1） 細胞学的特徴：メイギムザ（MG)染色ては、中型でほぼ円形のN/C比が中等度 の 細胞と、大 型で多核 の巨核球 様細胞と が混在していた。periodic―acid Shiff

（PAS）、PO、ズダンブラックB(SBB)、aーnaphttlyl butyrate esterase（ロ‑NBE)、 naphthol ASーDchloroacetate esterase（NACE)染 色陰 性 で 、GPHb／ma陽性 細 胞は巨核球 様細胞の ほかに中 型の細胞 にも認められた。表面マーカーは、CD2.

CD7、CD13、CD33、CD34、CD38丶CD41a、HLA―DRが陽性であった。TCR、Ig遺伝子 はgerm lineを 示 し た 。 接 着 因 子 は 、CDlla、CD441 CD54、LAAI1、VLA4、 VLA5が強陽性であった。

  2）サイトカイン反応性：GMーCSF、IL―3及びSCFに濃度依存性に増殖を示したが、

3者 間で相加・ 相乗効果は認められなかった。、他のサイトカインには反応を示さ ず 、Gll‑ CSFなどとの相加・相乗作用も認められなかった。TGF‑ロ、IFN‑rは濃度 依存性に、GH‑CSF依存性増殖を抑制した。

  3） サイトカイ ンレセプ ター：ヨ ードラベ ルサイト カインを 用いた検討では、

GM−CSFレセプター（GM−CSF/R)、IL−3/Rは2相性を示し、高親和性及び低親和性 レ セプタ の 存在が示されたo FACScanを用いた検討では、GM―CSF/R、IL−3/Rは GM―CSF、IL‑3によって発現の低下を認めた。G―CSF/Rは殆ど発現していなかった。

  4）分化能：TPAにより、hIG染色で形態学的に1まマク口ファージ様細胞に分化し た が 、 ロ ― NBE染 色 陰 性 で 、 CD14に は 変 化 が 認 め ら れ な か っ た 。   5） 抗癌剤に対する反応：AIIL(H1）患者の自血病細胞とPh1陽性急性リンパ性自 血病細胞株(HSH931）とを用いて比較検討した。本細胞のLD50はAML細胞より高く、

HSbl931と はCA、MT)【 以 外はHSbl911の 方が 高 く、 薬剤抵 抗性と考 えられた 。     考案及び結語．

  1）本細 胞株は、骨髄球系、Tリンパ球系、巨核球系の3系統の表面形質を有し、

TCRの再構 成を認めず、幼若な造血前駆細胞に発現している接着因子が強陽性で、

未熟な 造血前駆 細胞に作 用するIL−3、GM−CSF、SCFに 反応し、比較的成熟した 前駆細 胞に作用 するG―CSF、M−CSF、Epoには 反応しな ぃなどの点から、幼若な 前駆細胞の腫瘍化であることが示唆された。

  2）各種 抗癌剤に 対する反 応性が悪 く、臨床的にCD7陽性白血病が治療抵抗性で あるとする報告と一致していた。

  3） IF．N―アによって濃度依存的に増殖が抑制され、CD7陽性自血病のIFN−アに よる治療の可能性が示唆された。

  以 上 の結 果 から 、CD7陽性白 血病の治 療法のみ ならず、 白血病細胞 の増殖と 分化とを 検討する 上で有用 な細胞株 と考えられ た。

  以上より 、本研究は博士（医学）の学位論文として妥当なものと判断される。

―262−