博士（医学） 中垣 祐 学位論文題名

     博士（医学）   中垣   祐 学位論文題名

常染色体優性多発性嚢胞腎モデルマウスを用いた降圧薬      投 与 実 験 及 び 腎 内 RAS 関 与 に つ い て の 解 析

学位論文内容の要旨

【 背 景 と 目 的 】 常 染 色 体 優 性 遺 伝 性 多 発 嚢 胞 腎(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease：ADPKD)は 遺 伝 性 腎 疾 患 の 中 で 最 も 頻 度 が 多 く ， 加 齢 と と も に 嚢 胞 が 増 加 し ， 70才 ま で に 約 半 数 が 腎 不 全 に 陥 る と さ れ る 。 原 因 遺 伝 子 と し てPKD1とPK02が 同 定 さ れ ， 各 々 の 遺 伝 子 産 物 で あ る ポ リ シ ス チ ン1， ポ リ シ ス チ ン2は と も に 腎 の 上 皮 細 胞 の 繊 毛 に 局 在 す る 。 尿 流 を 感 知 す る 受 容 体 で あ る ポ リ シ ス チ ン1か ら の 刺 激 が カ ル シ ウ ム チ ャ ネ ル を 有 す る ポ リ シ ス チ ン2へ 伝 達 さ れ ， 尿 細 管 お よ び 集 合 管 細 胞 内 に カ ル シ ウ ム イ オ ン が 流 入 す る こ と に よ り ， 尿 細 管 径 の 調 節 が 行 わ れ る 。ADPKDで は ， ポ リ シ ス チ ン1，2の ど ち ら か の 機 能 が 喪 失 す る と ， 径 の 調 節 が で き ず ， 嚢 胞 が 形 成 さ れ る 。 ま たADPKD細 胞 で は 細 胞 内Ca濃 度 低 下 に よ り 細 胞 増 殖 カ ス ケ ー ド が 活 性 化 さ れ ， 嚢 胞 形 成 が 促 進 さ れ る と 考 え ら れ て お り ， カ ル シ ウ ム チ ャ ン ネ ル 拮 抗 薬(Calcium Channel Blocker：CCB)投 与 が 嚢 胞 進 行 に 悪 影 響 を 与 え る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る 。ADPKDに お け る 高 血 圧 の 合 併 は 約50〜 80％ に 見 ら れ ， 高 血 圧 は 腎 機 能 障 害 の 要 因 と な る こ と が 知 ら れ て い る 。 レ ニ ン ・ ア ン ジ オ テ ン シ ン 系(Renin‑Angiotensin‑system：RAS)の 関 与 が 示 唆 さ れ て い る が ， 血 圧 と 血 漿 レ ニ ン 活 性 と の 相 関 は 示 さ れ て お ら ず ， 発 症 メ カ ニ ズ ム は 明 ら か で は な い 。 一 方 で ，ADPKD に 対 す るRASの 亢 進 は ， 腎 嚢 胞 増 殖 の 成 因 と な る 可 能 性 や ， 腎 問 質 の 線 維 化 を も た ら す 独 立 し た 因 子 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る 。 近 年 ，RASに か か わ る 関 心 は ， 全 身RASか ら 局 所RASに 向 か っ て お り ， 腎 臓 内 に お け る 組 織RAS（ 腎 内RAS)の 重 要 性 が 証 明 さ れ て い る 。 最 近 の 報 告 で は ， 腎 内RAS活 性 の バ イ オ マ ー カ ー と し て ， ア ン ジ オ テ ン シ ノ ー ゲ ン (Angiotensinogen： AGT)の 尿 中 排 泄 量 が 指 標 と な る こ と が 示 さ れ て い る 。 本 研 究 に お い て は ， 降 圧 薬 投 与 に よ る 嚢 胞 形 成 へ の 影 響 を 調 べ る と と も に ， 新 し い 病 態 概 念 で あ る 腎 内 RASと の 関 わ り に つ い て 調 べ る こ と を 目 的 と し ，Pkdlコ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 用 い て 降 圧 薬 の 投 与 実 験 を 行 っ た 。

【 材 料 と 方 法 】 本 研 究 で は ；IFN誘 導 体 で あ るpolyinosinic‑polycytidylicacid (pI‑pC)に よ っ て ノ ッ ク ア ウ ト さ れ る ， 薬 剤 誘 導 型Pkdlコ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス(Pkdl noxmox;Mxl ‑Cre mice)を 作 製 し ， 使 用 し た 。 生 後14日 目 か ら のpI‑pC投 与 に よ っ て 最 も 安 定 し た 表 現 型 が 得 ら れ て お り ， 治 療 薬 投 与 実 験 が 可 能 な ヒ トADPKDの モ デ ル 動 物 と し て 適 し て い る 。 降 圧 薬 投 与 と し て は ， 表 現 型 が 野 生 型 で あ るControl群 ， 溶 媒 の み のVehicle 群 ， CCB投 与 群 (Amlodipine群 ） 、 ア ン ジ オ テ ン シ ン n受 容 体 拮 抗 薬(ARB)投 与 群

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(Olmesartan群 ） 、 直 接 的 レ ニ ン 阻 害 薬(DRI)投 与 群(Aliskiren群 ） 、 の5群 に 分 け て 解 析 を 行 っ た 。 薬 剤 投 与 方 法 は ， 浸 透 圧 ミ ニ ポ ン プ を 使 用 し ， 合 計12週 間 の 投 与 を 行 っ た 。 血 圧 は2週 毎 にtail‑cuff法 を 用 い て 測 定 し た 。22週 で 屠 殺 し ， 腎 （ 肝 ） 重 量 ・ 体 重 比 ，Cystic Indexを 測 定 し た 。 ま た ，BUN， 尿 中 ア ル ブ ミ ン 排 泄 量 ， 線 維 化 に つ い て の 病 理 組 織 学 的 検 討 ， 細 胞 増 殖 及 ぴ ア ポ ト ー シ ス に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 更 に ， 尿 中AGT排 泄 量 の 測 定 ， 免 疫 組 織 学 的 検 査 に よ るAGT， ア ン ジ オ テ ン シ ンu， レ ニ ン の 発 現 な ど ， 腎 内RASの 関 与 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。

【 結 果 】 血 圧 推 移 は ，Amlodipine群 ，Olmesartan群 ，Aliskiren群 で ， い ず れ もVehicle 群 と 比 較 し ， 有 意 か つ 同 等 な 降 圧 効 果 を 示 し た 。 腎 重 量 ・ 体 重 比 ，Cystic Index（ 腎 ） は ， 薬 剤 投 与 群 に お い てAliskiren群 で 最 も 小 さ く ，BUN， 尿 ア ル ブ ミ ン 排 泄 に つ い て もAliskiren 群 で 有 意 差 を 持 っ て 低 値 を 示 し て い た 。 一 方 ， 肝 臓 に つい て は ， 肝 重量 ・ 体 重 比 ，Cystic Index い ず れ も ， 薬 剤 投 与 群 間 で 差 は 認 め な か っ た 。 腎 問 質 の 線 維 化 と し て は ，aSMA (smooth muscle actin)染 色 ， 及 ぴElastica‑Masson染 色 に て ，Olmesartan群 とAliskiren群 で ， 有 意 な 線 維 化 抑 制 を 認 め た 。PCNA  (proliferative cellnuclear antigen)染 色 に よ る 細 胞 増 殖 は ，Olmesartan群 と Aliskiren群 で 有 意 に 抑 制 さ れ ， ア ポ ト ー シ ス は ，TUNEL   (terminal dUTP nick‑end labeling)染 色 に て ，Olmesartan群 とAliskiren群 で ， 有 意 に 抑 制 さ れ て い た 。 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 用 い た ， 細 胞 増 殖 因 子 の 蛋 白 発 現 量 に つ い て も ，Olmesartan群 とAliskiren群 で 有 意 に 減 少 し て い た 。 尿 中AGT排 泄 量 は ，Aliskiren 群 で 有 意 差 を 持 っ て 低 値 を 示 し て お り ，AGT， ア ン ジ オ テ ン シ ンn， レ ニ ン の 免 疫 組 織 学 的 検 査 に お い て も ，Aliskiren群 で 最 も 染 色 が 抑 制 さ れ て い る 傾 向 が 示 さ れ た 。

【 考 察 】ADPKDの 高 血 圧 で はRAS阻 害 薬 が 第 一 選 択 で は あ る が ， し ば し ばADPKD患 者 で は 十 分 な 降 圧 が 得 ら れ な い た め ，CCB等 の 多 剤 の 併 用 療 法 が 必 要 と な る 。 本 研 究 の 結 果 ， 今 回 の 観 察 期 間 に お い て は ，CCBは 嚢 胞 形 成 や 腎 機 能 に 悪 影 響 を 及 ば さ な い 可 能 性 が 示 さ れ た た め ，ARBの み で は 十 分 な 降 圧 が 得 ら れ な ぃADPKD患 者 に 対 し て は ， 選 択 肢 と し て CCBも 念 頭 に 入 れ て 治 療 を 進 め て い く 必 要 が あ る も の と 考 え ら れ た 。 ま た 尿 中AGT排 泄 量 が 増 加 し て お り ，ADPKDの 病 態 に 腎 内RASが 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 更 に DRI投 与 に よ っ て 尿 中AGT排 泄 量 が 有 意 に 減 少 し ，AGT， ア ン ジ オ テ ン シ ンII， レ ニ ン の 発 現 も 抑 制 さ れ て い た こ と か ら ，DRIが 腎 内RASを 抑 制 し 得 る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。DRI 投 与 に よ っ て 腎 臓 に お け る 嚢 胞 形 成 が 抑 制 さ れ ， か つ 腎 機 能 及 び 尿 ア ル ブ ミ ン 排 泄 の 悪 化 を 抑 制 し 得 た 背 景 に は ， 腎 内 RASが 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

【 結 論 】 本 研 究 で は ， 腎 内RASがADPKDの 病 態 に 深 く 関 わ っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 ま た ，ADPKDの 最 大 の 特 徴 で あ る 嚢 胞 形 成 に も 腎 内RASが 関 わ っ て い る 可 能 性 が 示 さ れ ， 今 後 の 更 な る 解 明 が 必 要 で あ る と 考 え る 。 更 に ， 直 接 的 レ ニ ン 阻 害 薬(DRI)のADPKD に 対 す る 嚢 胞 形 成 抑 制 と い う 可 能 性 に つ い て も 見 出 す こ と が で き ， 今 後 は ， 腎 内RASの 新 し い 知 見 を 踏 ま え ， 降 圧 薬 の 選 択 に も エ ビ デ ン ス レ ベ ル で 言 及 し ， 確 立 し て い く こ と が 重 要 で あ る と 考 え る 。

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

常染色体優性多発性嚢胞腎モデルマウスを用いた降圧薬      投 与 実 験 及 び 腎 内 RAS 関 与 に つ い て の 解 析

  高血圧 は，常 染色体優性遺伝性多発嚢胞腎(ADPKD)で高率に認められる合併症であり，レ ニン・アンジオテンシン系(RAS)の関与が示唆されているが，血圧と血漿レニン活性との相関 は示されていない。本研究では，ADPKDの病態に腎内RASが深く関与している可能性が示され，

RAS阻 害薬であ る直接 的レニン 阻害薬(DRI)投与 によっ て腎内RAS活性 が抑制された結果，

腎臓における嚢胞形成，腎機能，及び腎の線維化や尿中アルブミン排泄の悪化を抑制し得たこと が示唆された。

  審査ではまず，DRIのレニンに対する作用点や作用機序について質問がなされた。DRIとはレ ニンの活性部分に結合することにより，直接的にレニンの活性を抑える薬剤であると回答された。

続いて，腎内RASの免疫染色においてDRI投与によってレニンの発現が抑えられていることの 意義，そして全身のRASとしての傍糸球体細胞から発現するレニンとの違いについて質問がなさ れた。 腎内RASでは遠位尿細管上皮細胞や集合管の上皮細胞である主細胞でレニンが発現し vicious cycleを形成することで更にレニンの発現が亢進するが，DRI投与によって腎内RASが抑 制され遠位尿細管や集合管からのレニンの発現自体が抑えられている可能性が考えられ、傍糸球 体細胞から分泌されるレニンとは，発現機序が異なる可能性について説明された。次に，腎内RAS 抑制による腎の線維化抑制効果について，腎の嚢胞形成の程度による影響の有無について質問が され、嚢胞形成の程度とは無関係に腎の線維化を抑制した可能性について回答された。続いて，

同じRAS阻害薬 であるARBとDRIについて，効果などの差異について質問がなされた。これに 対し， 大規模臨 床試験のエビデンスが少なく，DRIとARBやACE阻害薬の使い方を明らかにし た知見は報告されていないと回答された。続いて，降圧薬投与による降圧効果について，腎内RAS と全身のRASのどちらを抑えていた可能性があるかにっき質問がなされた。これに対し，生後

一237一

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14週 の 時 点 でControl群 と ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス で あ るVe11icle群 を 比 較 し た と こ ろ ， 尿 中 ア ン ジ オ テ ン シ ノ ー ジ ェ ン の 排 泄 量 に 差 が 無 か っ た こ と か ら ， 少 な く と も 生 後14週 の 時 点 ま で は ， 腎 内 RASで は な く ， 全 身 のRASに 対 し て 効 果 が あ っ た も の と 考 え ら れ る と 回 答 さ れ た 。 次 に ，ADPKD に お け る 腎 嚢 胞 の 発 生 機 序 に つ い て 質 問 が な さ れ た 。 こ れ に 対 し ，ADPKDに お け る 嚢 胞 の 形 成 機 序 に つ い て 有 カ な 仮 説 と し て ， ツ ー ヒ ッ ト 説 が あ り ， 生 下 時 のPKD遺 伝 子 の う ち 一 方 が 障 害 さ れ た 生 殖 細 胞 変 異 （ ワ ン ヒ ッ ト ） と 生 後 の 他方 の 遺 伝 子 が 障害 さ れ た 体 細胞 変 異 （ ツ ーヒ ッ 卜 ） に よ り 発 症 し ， 体 細 胞 変 異 が 起 き た 尿 細 管 上 皮 細 胞 が モ ノ ク ロ ー ナ ル に 増 殖 し て 嚢 胞 を 形 成 す る 機 序 が 考 え ら れ て い る と 回 答 さ れ た 。 続 い て ，PKD2の 遺 伝 子 産 物 で あ る ポ リ シ ス チ ン2（PC2） の 構 造 に つ い て 質 問 が な さ れ た 。PC2は ア ミ ノ 酸 配 列 が 電 位 依 存 性 カ ル シ ウ ム イ オ ン チ ャ ネ ル に 類 似 し て お り ，Caイ オ ン な ど を 透 過 す るtransientreceptorpotentia1蛋 白 に 分 類 さ れ て お り ， イ オ ン 選 択 性 が 低 く ， チ ャ ネ ル 活 性 の 電 位 依 存 性 が 乏 し い と い う 特 徴 を 持 っ と 回 答 さ れ た 。 最 後 に ，ADPKDで の 嚢 胞 の 巨 大 化 に よ る 合 併 症 と 予 後 規 定 因 子 に っ き 質 問 が な さ れ た 。 腎 臓 に お い て は ， 嚢 胞 の 巨 大 化 に よ る 虚 血 性 の 病 変 や 糸 球 体 嚢 胞 の 形 成 な ど に よ ル ネ フ ロ ン が 障 害 さ れ て 腎 機 能 障 害 が 出 現 す る と 回 答 さ れ た 。 ま た ， 予 後規 定 因 子 に つ いて は ， 血 圧 の管 理 が 重 要 であ る が ， DRIやARBの 投 与 ， 更 に はCCBで あ る ア ム ロ ジ ピ ン の 併 用 投 与 が 血 圧 管 理 に お い て 有 用 で あ る 可 能 性 が 示 さ れ た と 回 答 さ れ た 。

  CCBで あ る ア ム ロ ジ ピ ン の 投 与 に つ い て の 可 否 を 調 べ ， 嚢 胞 形 成 に 悪 影 響 は 及 ば さ な ぃ 結 果 が 示 さ れ た こ と は 臨 床 的 に 意 義 が あ る も の と 評 価 さ れ た 。 ま た ，ADPKDの 病 態 に 腎 内RASが 関 わ っ て い る こ と ，DRI投 与 に よ っ て 腎 嚢 胞 形 成 が 抑 制 さ れ る 可 能 性 が 示 さ れ た こ と か ら ，DRIは 今 後 のADPKDの 治 療 と し て 期 待 さ れ る も の で あ り ， 臨 床 的 に も 有 意 義 な 研 究 で あ る と 評 価 さ れ た 。   審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

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