博士（医学）丹羽祐勝 学位論文題名
骨格筋に おける解 糖系の制御と PFK ― 2/PFKFB3 の関与 学位論文内容の要旨
骨 格 筋 は中 枢 神 経 か ら の 指 令 に よ り 隋 意 的 に 収 縮 す る ． その 原理 はア クチ ン， ミオ シ ン な ど の 収 縮蛋 白 が ア デ ノ シ ン3リ ン 酸(ATP)の 化 学 エ ネ ル ギ ーを 消費 して 収縮 する ．筋 肉 中 に 貯 蔵 さ れて い るATPは き わ め て 少 な いた め ， 運 動 を 長 時 間 継 続す るた めにはATPの再 合 成 が 必 要 に なる ． こ の 再 合 成 は す べて 生体 内で 行わ れ， 骨格 筋に おけ るATP供給 過程 のひ と っ が 解 糖 系 で あ る ． 解 糖 系 は 糖 質 代 謝 の 中 心 的 な 役 割 を 担 っ て お り ， そ の 律 遠 酵 素 は 6―phosphofructo−1−kinase（PFK−1） で あ る ． ま た ，PFK‑1の 活 性 化 因 子 と し て Fructose−2，6−bisphosphate (F2，6BP)カミ存在する．F2，6BPは6―phosphofructo−2ーkinase (PFK―2） によりFructose−6ーphosphate (F6P)から合成される．F2，6BPはATPのPFK−1活性の 阻害に拮抗し，PFK−1活性を亢進させ解糖系を活性化させる．
PFK−2は 同一 分 子 内 に キ ナ ー ゼ ド メ イ ン と フ オ ス フ ァ タ ー ゼド メイ ンを 持つ 二機 能性 酵 素 で ，4種 類 の ア イ ソ フ オ ー ム が 報 告 さ れて い る(PFKFB1〜4)．各 アイ ソフ オー ムは キナ ー ゼ ・フ オス ファ ター ゼの 活性 比が 異な り，PFKFB3蛋白 はキ ナー ゼ活 性が 最も 高く ，癌 細胞 や 胎 盤 な ど の 増殖 が さ か ん な 臓 器 に 高発 現し てい る． また 、腫 瘍細 胞のPFKFB3遺伝 子をsiRNA で ノ ッ ク ダ ウン す る こ と に よ り 細 胞 増 殖 を 抑 制 す る こ と が 報 告さ れて いる ．PFKFB3遺伝 子 は19の エ ク ソン で 構 成 さ れ ， エ ク ソ ン13か ら19は 選 択 的 ス プ ライ シン グに より 組織 特異 的 な 発現 様式 を示 す． しか し， 各ア イソ フオ ーム の働き の違 いや 特徴 は解 析さ れて いな い． 糖 代 謝 とPFKFB3に 関 し て ，AMP−activated protein kinase (AMPK)によ りPFKFB3蛋白 のセ リ ン461が り ン 酸 化 さ れ キ ナ ー ゼ 活 性が 亢進 する ことが 報告 され ，イ ンス リン のシ グナ ル伝 達 との 関連 は，PFKFB3蛋 白はPKB，PKCな どによルリン酸化されることが報告されている．また，
こ れ ま で の 報告 で は 糖 尿 病 と 解 糖 系 の 関 与 と し て ， 肝 臓 に お ける グル コキ ナー ゼの 酵素 活 性 低 下 に よ って 惹 起 さ れ るmaturity onset diabetes of the young 2(MODY2） が知 られ て い る の み で ある ． 解 糖 系 は 糖 尿 病 治 療 へ の 応 用 と い う 点 で は 未開 発の 分野 であ る． 今回 私 は ， 骨 格 筋 の組 織 特 異 的 な 解 糖 系 調 節 機 構 に 注 目 し ， エ ネ ル ギー 消費 の観 点か ら糖 代謝 異 常 の 治 療 の 標的 因 子 を 明 ら か に す る目 的で ，PFK−2/PFKFB3の 発現 と機 能の 解析 を行 った ． 骨 格 筋 に お け る 低 酸 素 に よ る 解 糖 系 の 亢 進 とPFKFB3の 関 連 を 明 ら か に す る た め ，C2C12 筋 管 細 胞 を 低 酸 素 に 暴 露 し た ．3時 間 と24時 間 後 の 総RNAを 抽 出 し ，RT−PCRでPFKFB3 mRNAの 発 現 量を 正 常 酸 素 濃 度 下 で 培 養 し た 細 胞 と 比 較 し た ． 低酸 素に 暴露 され た細 胞に 船 いて3時間後と24時間後にPFKFB3 mRNAが高発現した．
骨 格 筋 に お け る 炎 症 刺 激 に よ る 解 糖 系 の 亢 進 とPFKFB3の 発 現 誘 導 の 関 連 を 明 らか に す る た め ， 無 血 清 培 地 で 前 処 理 し たC2C12筋 管 細 胞 にLPSを 作 用 さ せ た ． 刺 激 後3時 間 で PFKFB3 mRNAの 発 現 を 測 定 し た ．LPSの 濃 度 依 存 性 にPFKFB3 mRNAの 発 現 が 亢 進 した ． ま
た，骨格筋に茄いて解糖系が亢進した際に高発現する IL ー 6mRNA もLPS の濃度依存性に高 発現した．
骨格筋おけるPFKFB3 遺伝子の選択的スプライシングによる組織特異的な発現様式を検 討 す るた めエ クソ ン13 か ら19 を特 異的 に増幅 する プラ イマー を用 いて RT − PCR を施 行 し た ． C2C12 筋 管細 胞 で は ， 270bp と 90bp に PCR 産 物 が 認 め ら れ ， エ クソ ン13 から 19 を それぞ れエ クソ ン A から G とすると，エクソンA ， C ， G とエクソンA ，G が含まれると推 測 された ，ま た， マウス 骨格筋では 280bp と 270bp ，90bp に PCR 産物が認められ，エクソ ン A ，C ，D ， G とエクソンA ，C ， G とエクソンA ，G が含まれると推測された．さらに，これら の PCR 産物をサブクローニングし，シークエンスを行い各スプライシングアイソフオーム を確認した．それぞれのアイソフオームをPFKFB3 ―ACDG ，PFKFB3 一ACG ，PFKFB3 ―AG と命名し た・
8 週令 BALB/c マウスを24 時間絶食後，腹腔内にLPS1 ．OLig/g （体重）を投与し， 3 時間 後 に骨格 筋を 摘出 し総RNA を抽出した．骨格筋おけるPFKFB3 遺伝子の選択的スプライシ ン グによ る発 現様 式を検 討す るた めエ クソン 13 か ら 19 を増幅するプライマーを用いて RT 一PCR を施行した， PBS 投与群の骨格筋ではヒラメ筋，大腿筋ともにPFKFB3 ―ACDG が発現し て韜り，LPS 投与群の骨格筋では，ヒラメ筋，大腿筋ともにPFKFB3 一 ACG の発現が有意に 増強していた．
PFKFB3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に よ る ア イ ソ フ オ ー ム で あ る PFKFB3 ― ACDG と PFKFB3 ― ACG を HEK293 細 胞 に 遺 伝 子 導 入 後 ， 安 定 株 を 樹 立 し 各 ク ロ ー ン の 2 − deoxy ―[3H] glucose の取り込みとF2 ，6BP 量を比較した．それぞれのアイソフオームを導 入した細胞群ではempty vector を導入した対照群と比較し，有意に2 −deoxy ―[3H] glucose の 細 胞 内 へ の 取 り 込 み が 増 加 し ， ま た F2 ， 6BP 量 が 増 加 し て い た ． F2 ， 6BP 量と糖尿病の関連を調べるため、肥満 2 型糖尿病のモデルマウスである11 週令 めノ'db マウスと+m/ 協マウスの下肢骨格筋のF2 ， 6BP 量を測定したところ，而群における F2 ，6BP 量に差は認めなかった．
これらの結果から，骨格筋におけるPFKFB3 は解糖系の制御に大きく関与していることが 示唆された，骨格筋におけるインスリンシグナルとPFKFB3 の関連にっいて解明していくこ とは，インスリン感受性組織におけるPFKFB3 による解糖系調節機序を明らかにすることに 繋がると考えられる．また、PFKFB3 の活性化機序を解明し，骨格筋の解糖系を亢進させる ことができれば，エネルギー消費の観点から糖尿病の新しい治療法の開発に繋がる可能性 が考えられる．
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
骨格筋に おける解 糖系の制御と PFK ― 2/PFKFB3 の関与
骨 格筋 はア デノシ ン3リン 酸(ATP)の化学エネルギーを消費して収縮する．
筋 肉内 のATP量は 極め て少 なく ，運 動を継続するためにはATPの再合成が必要に な る ． こ の ATP供 給 過 程 に 解 糖 系 が 存 在 す る ． 解 糖 系 の 律 遠 酵 素 は 6ーphosphofructo−1―kinase (PFK―1）である．また，PFK―1の活性化因子として Fructoseー2，6―bisphosphate (F2，6BP)が 存 在 す る ． F2，6BPfま 6―phosphofructo―2−kinase (PFK−2）によりFructose−6―phosphate (F6P)から 合成される．F2，6BPはATPのPFKー1活性の阻害に拮抗し，PFK−1活性を亢進させ解 糖系を活性化させる，
PFK―2は 同一 分子内 にキ ナー ゼド メインとフオスファターゼドメインを持つ 二 機能 性酵素で，4種類のアイソフオームが報告されている．各アイソフオーム はキナーゼ・フオスファターゼ活性比が異なり，PFKFB3蛋白はキナーゼ活性が最 も 高い ．PFKFB3遺伝子 は19のエ クソ ンで構成され，エクソン13から19は選択的 スプライシングにより組織特異的な発現様式を示す．しかし，各アイソフオーム の働きの違いや特徴は解析されていない，
今回 私は ，骨 格筋の 組織 特異 的な 解糖系調節機構に注目し，エネルギー消費 の 観点 から糖代謝異常の治療の標的因子を明らかにする目的で：PFK―2/PFKFB3 の発現と機能の解析を行った・
骨 格 筋 に お け る 低酸 素に よる 解糖 系の 亢進 とPFKFB3の関連 を明 らか にす る た め，C2C12筋管 細胞 を低 酸素 に暴 露した．PFKFB3 mRNAの発現は時間依存性に 増加した・
骨 格 筋 に 韜 け る 炎症 刺激 によ る解 糖系 亢進 とPFKFB3の発現 誘導 の関 連を 明 ら か に す る た め ，C2C12筋 管細胞 にLPSを 作用 させ た． 刺激後3時 間で はLPSの 濃 度依 存性 にPFKFB3 mRNAの発 現が 亢進 した ．また ，骨 格筋 の解 糖系が亢進し た 際 に 高 発 現 す る IL− 6mRNAも LPSの 濃 度 依 存 性 に 高 発 現 し た ． 骨 格 筋 お け るPFKFB3遺伝 子の 選択 的ス プラ イシ ング による 組織 特異 的な 発 現 様 式 を 検 討 す る た め RT−PCRを 施 行 し た ． C2C12筋 管 細 胞 で は PFKFB3−ACDG，PFKFB3一AGが発現し，マウス骨格筋ではPFKFB3ーACDG，PFKFB3―ACG， PFKFB3―AGが発現してしヽた．
BALB/cマ ウ ス にLPSを 投 与 し ，3時 間後 に 骨 格 筋 を摘 出しRTーPCRを 施行 し
夫 次
弘
隆 鎮
充
池 山
岡
小 畠
吉
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
た，対照 群ではPFKFB3一ACDGが発現して おり，LPS投 与群ではPFKFB3一ACGの発 現が有意に増強していた．
PFKFB3の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ ア イ ソ フ オ ー ム で あ るPFKFB3ーACDGと PFKFB3―ACGをHEK293細 胞 に 遺 伝 子 導 入 後 ， 安 定 株 を 樹 立 し 各ク ロ ーン の 2−deoxy―[3H] glucoseの取り込みとF2，6BP量を比較した．それぞれのアイソフ オームを導入した細胞群では対照群と比較し，有意に2−deoxy−［3H] glucoseの 細 胞 内 へ の 取 り 込 み が 増 加 し ， ま た F2， 6BP量 が 増 加 し た ． F2，6BP量 と糖 尿病 の関連を 調べるた め，db7dbマウ スと+m/砺マウ スの下肢 骨 格 筋 のF2，6BP量 を 測 定 し た が ，両 群 のF2，6BP量 に 差 は認 め な かっ た ． これらの 結果から ，骨格筋に おけるPFKFB3は 解糖系の 制御に大 きく関与して いることが示唆された・
質 疑 応答 に おい て は 畠山 教 授か ら ，C2C12筋 管細 胞 にお け る 解糖 系 亢進 と T0111ikereceptorの 関 連 ，骨 格 筋とC2C12細 胞 の アイ ソ フオ ー ム の違 い につ いて，C2C12細 胞の分化 前後のアイ ソフオームに関して，PFKFB3スプライシング アイ ソ フオ ー ム の発現 調節機構 ，PFKFB3mRNAとRNAbindingproteinに関 して、
安定発現 株のグルコースの取り込みの機序について，質問があった．次に吉岡教 授から，PFK―2のノックアウトマウスに関して，PFK―1とPFK―2活性の違いについ て，C2C12筋管 細胞とグ ルコースト ランスポーターに関して，骨格筋のグルコー ス取り込 みの機序 について質 問があっ た．次に小池教授から，LPSの解糖系亢進 に お け るinvivoとinvitroの 違 い に つ い て ，IL一6を 阻 害 す る 実 験 に つ い て，PFKFB3遺伝 子とスプ ライシング 発現部位 について ，PFKFB3を糖尿病治療に 用いる場 合の展望に関して質問があった．いずれの質問に対しても，申請者は概 ね適切に回答した．
本論 文 にお け る 検討 か ら ，PFKFB3の活 性 化 機序 の解明は糖 尿病の新 しい治療 法の開発に繋がる可能性が考えられた．
審査委員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得 単位など も併せ申 請者が博士 （医学） の学位を 受けるの に充分な 資格を有する ものと判定した．
