博 士 （ 獣 医 学 ） 金 井 祐 太
学 位 論 文 題 名
北 海 道 の 野 生 動 物 に 見 ら れ る ト リ ヒ ナ の 分 類 と ト リ ヒ ナ 症 の 流 行 状 況
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
トリ ヒ ナ 症は 、 現 在で も世 界中で 多くの患 者が報 告されて いる人獣 共通寄 生虫症で ある 。以前は 人体ト リヒナ症 の感染 源として 豚が重要 視されていたが、野生動物にも広 く流行していることが明らかとなっている。これに関連して、トリヒナはさまざまな種もしく は遺 伝型を含 むこと が明らか にされ てきた。 近年、ト リヒナの種あるいは遺伝型の同定 に 有 用なmultiplex PCR法 が開 発 さ れ 、野 外 で の各 ト リヒナの 世界的 な分布が 明らか に な って き た 。国 内 で は1970−80年代に 野生動物 のトリ ヒナの疫 学調査 が広く行 われ た が 、当 時 は 数例 の 感 染例 が見っ かったの みであり 、日本 の野生動 物にお けるトリ ヒ ナ 症 の感 染 率 はき わ め て低 いと考 えられた 。その後 、国内 のトリヒ ナ症の 疫学調査 は ほとんど行われてこなかった。
北海 道 に おい て も1980年代 に 行 われ た ト リ ヒナ の 調査で は、キツ ネ198頭および ヒ グマ89頭を含む 野生動 物が検査 された が、筋肉 トリヒ ナは検出されなかった。しかし、
1999年 に なっ て 小 樽市 で キ ツネ43頭中5頭 に トリ ヒ ナ感 染が見っ かづた にのトリ ヒナ はF nativaとして報告されたが、後にTrichinella T9と訂正された）。また同じ頃に、以 前に 本州から分離されたトリヒナがTrichinella T9として新記載された。これは日本から のみ報告されている種（もしくは遺伝型）である。このようなことから日本におけるトリヒナ 症 の 動物 疫 学 調査 を 再 び行 う 必 要が あ る と考 え ら れ た。 本 研 究で は 北 海道 の 野生 動 物に おけるト リヒナ 症の調査 を行い 、分離さ れたトリ ヒナの特徴を生物学的および分子 生物学的に調べた。
第I章 で は2000−2006年 に 北海 道 で 捕 獲さ れ た 野生 の キ ツネ319頭 、 タ ヌキ77頭 、 ヒ グ マ126頭 、 イ タ チ4頭 、 齧歯 類344頭 お よ び食 虫 類27頭 に つい て 、 ペプ シ ン 消化 法によって、筋肉トリヒナの検索を行った。その結果、キツネ44頭（感染率：13．8％）、タ ヌキ6頭（7．8％）、ヒグマ4頭（3．2％）から筋肉トリヒナが検出された。このうちキツネ41頭、
タ ヌ キ6頭 は 小樽 市 で 、残 る キ ツネ3頭 は札 幌 市 、 士別 市 お よび 音 更 町で 捕 獲 された も の で 、 ヒ グ マ4頭 は 熊 石 町1頭と 赤 平 市3頭 で あ った 。 小 樽市 市 街 地近 郊 の 山林 間
の 農 地 を 中 心 に 捕 獲 さ れ た キ ツ ネ の 成 獣 と札 幌市 の市 街 化調 整区 域で 捕獲 した キツ ネ の成 獣の トリ ヒナ 感染 率を 比較 した とこ ろ 、小 樽市 のキ ツネ に有 意に高い感染率が 認められた（4．5％，1／22）（X2 test，p<0.05)。
小 樽 市 で 捕 獲 し た キ ツ ネ206頭 お よ び タ ヌ キ66頭 に つ い て 犬 歯 の セ メン ト質 年輪 か ら宿 主の 年齢 を推 定し た。 宿主 の性 別、 年 齢お よび 捕獲 年が トリ ヒナ感染率ヘ及ば す 影響 を調 べる ためロジスティ ック回帰分析を行ったところ、キツネでは年齢の上昇に 伴 い ト リ ヒ ナ 感 染 率 が 上 昇 す る 事 が 分 か っ た （ オ ッ ズ 比 〓 2.006，95%信 頼区 間〓
1.501―2.681，p<0.001)。 一 方 、 タ ヌ キ では その よう な 相関 は認 めら れな かっ た。
得ら れた 筋肉 トリヒナを用い てmultiplex PCRおよぴミト コンドリアCOI遺伝子の塩基 配 列解 析に よる 同定を試み、音 更町のキツネから得られたトリヒナはf nativa、その他 の5市 町 に お い て 捕 獲 さ れ た キ ツ ネ21頭 、 タ ヌ キ2頭 お よ び ヒ グ マ4頭 から 得ら れた ト リヒ ナはTrichinella T9と 同定 され た。 この結果から北 海道東部にはFnativa、西部 にはTrichinella T9と いう分布が示唆された。
第II章で は野 外に おけ るト リヒ ナの 感染 経 路、 特に キツ ネの 主た る餌であるエゾヤ チ ネズ ミの 関与 の可能性を解明 するために、エゾヤチネズミに対するトリヒナの感染実 験 を試 みた 。感 染に は北 海道 にお いて 分離 さ れた ．アnativaお よびTrichinella T9を 用い、コントロールとしてF spむ畄ふを使用した。また、比較のためにスナネズミ、マウス お よび ラッ トに っい ても 感染 を行 った 。マ ウスおよびラッ トではF叩施仏感染動物から Fnaf九 儡 お よ ぴn伽 面e仏T9感 染 と 比 較 し 、顕 著に 多く の 筋肉 トリ ヒナ が回 収さ れた が、エゾヤチネズミで は3種の筋肉トリヒナの寄生 虫体数に差は見られなかった。また、
エ ゾ ヤ チ ネ ズ ミ のfna灯 旧 お よ び 鮒 血eぬT9感 染で はマ ウ スお よぴ ラッ トよ りも 多く の 筋肉 トリ ヒナ が得られる傾向 があった。一般にスナネズミが最も感受性が高いことが 示唆され、エゾヤチネ ズミにも感染することが明らかとなった。さらに、感染エゾヤチネ ズミより得られた筋肉 トリヒナをスナネズミに実験感染させたところ、その感染能が確認 さ れた 。第I章 の エゾヤチネズミ217頭の調査ではトリヒナは検出されなかったが、この 感 染実 験に よル エゾ ヤチ ネズ ミが キツ ネへ の 感染 源と なる 可能 性が あることが示され た。
トリ ヒナ は異 なる種同士の交 雑が可能であることが知られており、野外における自然 交 雑個 体も 報告 され てい る。 また ーつ の宿 主 に複 数種 のト リヒ ナが 同時感染している 例 も 数 多 く 知 ら れ て い る 。 第m章 で はFロatA′aと 襾 出 血e仏T9を 用 い て交 雑感 染実 験 を 行 い 、Fmガ 珊 早vs．nm血 出T9♂ の 組 み 合 わ せ の 時 に の み 両 種 のF1交 雑 個 体が 出来 るこ とを示した。し かし交雑群の筋肉トリヒナ数はコントロール群に比べ有 意に少なく、筋肉トリ ヒナの体長はコントロール群に比べ有意に短いことが示された。ま た、コントロール群の 筋肉トリヒナの性構成は雄の比率が39．5−50．O％であったのに対
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し 、 交 雑 群 で は98―100%が 雄 で 、F2世 代 が 出 来 な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 現 在 知 ら れ て い る ト リ ヒ ナ の同 定方 法で はF1交雑 個体 を鑑 別 する こと は出 来な い た め 、PCRーRFLP法 に よ る 交 雑 個 体 検 出 法 の 開 発 を 試 み た 。Fnativaお よ び Trichinella T9の 核DNAのITS2領 域 を 増 幅 す る 共 通 プ ラ イ マ ー を 作 成 し 、Fnativa お よびTrichinella T9の.ITS2領域 の塩 基配 列を 決定 した 後、 両 種で 異な る切 断パ タ ー ン を 示 す 制 限 酵 素ApoIを 用 いPCR一RFLPを 試 み た 。 ま ずFnativa、Trichinella T9お よ び 両 種 の 抽 出DNAを 混 合 し た も の をPCRで 増 幅 し た と こ ろ い ず れ も400bp付 近 に 単 一 の バ ン ド が 見 ら れ 、 こ のPCR産 物 の 制 限 酵 素Ap01処 理 で はrnativaで は 3本(65bp，153bp，179bp)、Trichinella T9では2本(179bp，219bp)のバンドが見られ た 。 し か し 、 両 種 の 抽 出DNAを 混 合 し た も の とFl交 雑 個 体 のDNAを 用 い て PCR−RFLPを 行っ たと ころ 、Trichinella T9のパターンのみ検 出され、雌親（Fnativ） 由 来 の 核DNAが 検 出 で き な か っ た 。 こ のPCR−FRFLPの 改 善の 必 要性 はあ るも のの 、 雄 親 （ 刪 め 血e仏T9） の 核DNAがF1に引 き継 がれ てい るこ とは 確 認さ れた 。さ らに 、 F1交 雑 個 体 の ミ ト コ ン ド リ アCOI遺 伝 子 の 塩 基 配 列 解 析 で は 、Fmガ 珊 のCOI遺 伝 子 を保 有す るこ とが 確認 され た。 こ のよ うに 、PCR―RFLP法に よ るFl交雑 個体 の検 出 法 の 開 発 は 出 来 な か っ た が 、 今 回 作 出 し たFl交 雑 個 体 が 、F舳 伽 とn伽 め 舶T9 の両方の遺伝子を 持つ交雑個体であることは確認できた。
第W章 では1968年に 札幌 市円 山動 物園 のホ ッキ ョク グマ （ス カ ンジ ナビ ア半 島産 ） か ら分 離さ れたnm血e仏sp．を 用い 、こ のト リヒ ナの 分子 生物 学 的船 よび 生物 学的 な 解 析を 行い 、北 海道 に分 布す るF門atf弛 （音 更） との 近縁関 係について考察した。ま ず 、MultiplexPCRに より この 虫体 はrnaぬ旧 であ るこ とが 判明 し た（ 以下Fm灯 他（ 札 幌1968）と呼ぶ） 。このrnatA′a（札幌1968）、北海道産のfnatん儡（音更）および他の ト リヒ ナ種 にっ いてGenBankの データも含めて詳細に比較した ところ、FnafA′a（札幌 1968）が北欧のF口aむ偲よりF閲ガ珊（音更） に近いことが示唆された。さらに、両者の 交 雑実 験で は正 常にF1が 作出 され た 。こ れら の結 果を もとに ホッキョクグマの感染経 路について考察し た。
以上 のよ うに 、本 研究 では 、北 海 道の 野生 動物 から 検出さ れたトリヒナの分類学的 位 置を 、遺 伝子 解析 と寄 生虫 の交 雑 実験 から 明ら かに し、ま た、その流行状況を解明 し、その感染経路 を考察した。
学位論文審査の要旨
主、査 副査 副査 副査
助教授 奥 教 授 片 教 授 高 助教授 鈴
祐三郎 倉 賢 島 郁夫 木 正嗣
学 位 論 文 題 名
北海道の野生動物に見られるトリヒナの分類と トリヒナ症の流行状況
ト リ ヒ ナ 症 は 公 衆 衛 生 上 重 要 な 人 獣 共 通 寄 生 虫 症 で 、 人 の 感 染 源 と し て 豚 が 重 要 視 さ れ て い た 。 し か し 、 ト リ ヒ ナ の 分 子 生 物 学 的 解 析 が 発 達 し 、こ れを 用 いた 動物 疫 学 調 査 や 生 物 学 的 特 徴 の 研 究 が を さ れ 、 様 々 な 種 が 含 ま れ る こ と が 知 ら れ る よ う に な っ た 。 特 に 、 ほ と ん ど の 種 が 野 生 動 物 に お い て 広 く 流 行 し て いる こと が 明ら かと な っ て き た 。 国 内 に お け る 人 の 集 団 発 生 に 関 連 し て 行 わ れ た1970−80年 代 の 調 査 で 、 野 生 動 物 に お け る ト リ ヒ ナ の 感 染 率 は き わ め て 低 い と 考 え ら れた 。し か し、1999 年 に な っ て 北 海 道 で ト リ ヒ ナ が 流 行 し て い る こ と が 示 唆 さ れ 、 よ り大 規模 な 動物 疫学 調査とトリヒナの分子生物学解析が必要と考えられた。
そ こ で 、 申 請 者 は 動 物 疫 学 調 査 と し て2000−2006年 に 北 海 道 に お い て 捕 獲 さ れ た キ ツ ネ319頭 、 タ ヌ キ77頭 、 ヒ グ マ126頭 、 イ タ チ4頭 、 齧 歯 類344頭 お よ ぴ 食 虫 類27頭 に つ い て 、 ペ プ シ ン 消 化 法 に よ っ て 筋 肉 ト リ ヒ ナ の 検 索 を 行 っ た 。 そ の 結果、キツネ（感染率＝13．8％）、タヌキ（7．8％）、ヒグマ（3．2％）から筋肉トリヒナが検出 さ れ 、 キ ツ ネ で は 年 齢 に 伴 い ト リ ヒ ナ 感 染 率 が 上 昇 す る 事 が 示 さ れた 。ま た 、キ ツネ の 感 染 率 に お け る 顕 著 た 地 域 差 が 認 め ら れ 、 山 林 間 の 農 地 が 主 で あ る 小 樽 市 で は 感 染 率 が 高 く 、 市 街 化 調 整 区 域 が 主 で あ る 札 幌 市 で は 感 染 率 が 低 か っ た 。 北 海 道 の ト リ ヒ ナ の 分 子 生 物 学 的 解 析 の た め に 、 上 記 の 調 査 で 検 出 さ れ た 筋 肉 ト リ ヒ ナ を 用 い てmultiplex PCRお よ び ミ ト コ ン ド リ アCOI遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を 解 析 し たと ころ 、音 更 町の キツ ネ1頭か ら得 られ た トリ ヒナ はTrichinella nativa、その他の 5市 町 に お い て 捕 獲 さ れ た キ ツ ネ21頭 、 タ ヌ キ2頭 お よ び ヒ グ マ4頭 か ら 得 ら れ た トリヒナはTrichinella T9と同定された。
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こ れ らの ト リ ヒナ の 伝 播に お け るキ ツ ネ の重 要 な 餌 であ る 齧 歯類 の 関 与の 可 能 性を検討するために、野ネズミの調査を行ったが、筋肉トリヒナは検出されなかった。
一方 、 北 海道 に 船 いて 分 離 され たr nativaお よ ぴTrichinella T9を 用い た 感 染実 験では、 エゾヤチ ネズミ がこれら のトリ ヒナに対 し高い 感受性を有している事が示さ れた。
な お 、国 外 に 韜い て 別 種のト リヒナ が野外に おいて 交雑する ことが報 告され てい るが 、 北 海道 で 分 離さ れ たf nativaとTrichinella T9を 用 いて 交 雑 の可 能 性 につ いて調べ た。すな わち、 両トリヒ ナの交 雑実験を 行い、F nativa# vs. Trichine．ぬ T9♂ の 組み 合 わ せ時 に の み両種 のFl交雑 個体が産 出され ることを 示した 。しかし 、 交雑群の筋肉トリヒナ数はコントロール群（同種感染群）に比べ少なく、また筋肉トリ ヒナの体 長はコン トロー ル群に比 ベ小さ いことが 示され た。さらに、コントロール群 の筋肉ト リヒナの 雄の比 率が36−50％であったのに対し、交雑群では98−l0096であっ た 。 こ れ ら の 結 果 はF2世 代 が 産 出 困 難 で あ る こ と 示 唆 し 、 ア 閲 釘 ぬ とnmme仏 T9は生殖隔離されていると考えられた。
こ れ ら の 交 雑 ト リ ヒ ナ 検 出 の ため に 、fna灯 ぬ およ びnた轟 加e仏T9のITS2領域 を 増 幅 し 、 制 限 酵 素 を 用 い たPCR−RFLPを 試 み た。 プ ラ イマ ー が 適切 で な かっ た 為 と 予 想 さ れ る が 、PCRlRFLP法 に よ るF1交 雑 個 体 の 検 出 法 の 開 発 は 出 来 な か った 。 し かし 、 ミ トコ ン ド リアCOI遺 伝 子 の解 析 結 果 も含めて 、今回作 出したF1交 雑 個 体 が 、 rm幽 閉 と 乃 伽 血 舶T9の 両 方 の 遺 伝 子 を 持 つ 交 雑 個 体 で あ る こ と は確認された。
最 後 に、1968年 に 札幌 市 円山動 物園のホ ッキョク グマ（ スカンジ ナビア 半島産）
から 分 離 され た 眦 カ面eぬsp． と 北海 道 に 分布 す る ト リヒナと の近縁関 係につ いて 検討した 。multiplexPCRによ ルホッ キョクグ マの虫 体はrnaむ旧であ ること を解明し た（以下FnafA′a（札幌））。このFロaff珊（札幌）、前述のァnafA′a（音更）および他 のト リ ヒ ナ種 に つ いて 詳 細 に比 較 し たと こ ろ 、Fna細 旧（ 札 幌 ）が 北 欧 のFmd伽よ りFロafA′a（音更）に近いことが示唆された。また、アmむ珊（札幌）とFnafA′a（音 更） の 交 雑実 験 で は正 常 にFlが 産 出さ れ た 。こ れ ら の 結果 を も とに 円 山 動物 園 の ホッキョクグマの感染経路にっいて考察した。
以 上 、申 請 者 は北 海 道 にお け る 野生 肉 食 獣の ト リ ヒ ナ症 の 流 行状 況 調 査と 分 子 生物 学 的 な解 析 か ら新 知 見を 得て、 我が国に おけるト リヒナ 症の基礎 情報を 提供し た。 よ っ て、 審 査 員一 同 は 、上 記 博 士論 文 提 出者 金 井 祐 太の 博 士 論文 は 、 北海 道 大 学 大 学 院 獣 医 学 研 究 科 規 程 第6条の 規 定 によ る 本 研 究科 の 行 う博 士 論 文の 審 査 等に合格と認めた。
