博 士 （ 理 学 ） 吉 田 栄 人
学 位 論 文 題 名
マ レ ッ ク 病 ウ イ ル スの 主 要 抗 原の 遺 伝 子 同定 と 組 換 え フ ァ ウ ル ポ ッ ク ス ウ ィ ルス を 利 用 した 遺 伝 子 産物 の 解 析
学 位 論 文 内容 の 要 旨
研究の背景
マレック病(MD)はMarek．s disease virus(MDV)の感染に起因するニワトりの伝染性悪性 リ ン バ 腫 で あ る 。MDVは へ ル ベ ス ウ ィ ル ス 科 に 属 し3つ の 血 清 型 に 分 類 さ れ る 。 血 清 型1 (MDV‑1)は 腫 瘍 原 性 が 強 くMDの 病 因 ウ ィ ル ス で あ る 。 血 清 型2(MDV‑2)は 腫 瘍 原性 を欠 く。 血清 型3 (MDV‑3)はherpesvirus of turkey (HVT)として知ら れており、
MDV‑2と 同 様 に 腫 瘍 原 性 を 欠 く 。 病 原 性 を 示 さ な いMDV‑2とMDV‑3はMDV‑1に 対 す る 混 合2価 生 ワ ク チ ン と し て 現 在 使 用 さ れ て い る 。MDワ ク チ ン は 、 ワ ク チ ン 株 が 体 内 で 増 殖 し て 持 続 感 染 を 起 こ し 、 こ れ に よ り 野 外 強 毒 ウ イ ルス の感 染に よっ て引 き起 こ さ れ るMD病 変 形 成 を 阻 止 し て い る 。 し か し な が ら 完 全 には 感染 を阻 止で きな ぃた め ワ ク チ ン 株 と 野 外 ウ ィ ル ス の 重 感 染 が 生 じ 、 さ ら に 感 染ニ ワト りか らは ウィ ルス の 排 泄 が 常 時 行 わ れ る た め に 環 境 か らMDVを 完 全 に は 除 去 で き な い 。 こ の よ う な 現 状 よ りMDVの 分 子 レ ベ ル で の 解 明 を 通 じ て 、 ニ ワ ト り の 飼 育 環 境 に 適 応 し 、 簡 便 で 安 全 性 に 優 れ 、 か つ100％ 感 染 防 御 す る 次 世 代 ワ ク チ ン の 開 発 が 望 ま れ て い る 。
研究の目的
MDVの 分 子 レ ベ ル の 解 明 は 他 の へ ル ベ ス ウ イ ル ス に 比 べ て 著 し く 遅 れ て い る 。 そ の 最 も 大 き な 理 由 は 、MDVは 細 胞 随 伴 性 が 強 く 、 子 ウ ィ ル ス は 細 胞 内 に と ど ま り 、 培 養 上 澄 に は 放 出 さ れ な ぃ 点 に あ る 。 近 年 、 遺 伝 子 工 学 の 応用 によ り、 よう ゃく ウ イ ル ス のDNAレ ペ ル で の 解 析 が 可 能 に な っ た が 、 遺 伝 子 産 物 の 機 能 に つ い て は 、 ま だ十分な解明はなされていないのが現状である。
本 研 究 の 目 的 は 、MDVの 分 子 レ ベ ル で の 解 析 を 行 い 、MDVの 感 染 防 御 に 関 与 す る 抗 原 タ ン パ ク を 同 定 す る こ と で あ る 。 本 論 文 で は 、 特 にMDV maorenvelope glycoproteinであるglycoproteinBQB）およびglycoproteinL（gL）の機能・生理活性、さらに感 染 防御 効果 を組 換え フん ウ ルポ ック スウ ィル ス（FPV：fowlpoxvhs）発現システムを利 用 し て 解 析 し た 。gBは 、 糖 タ ン パ ク と し て は ヘ ル ベ ス ウ ィ ルス 間で 最も 良く 保存 さ
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れ て い る 。HSV‑1の 研 究 よ り 、gBは ウ イ ル ス の 宿 主 細 胞 へ の 侵 入 、cell‑to‑cell fusionの 機 能 を 有 し て い る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。 さ ら に 、 宿 主 の 感 染 防 御 に 関 与 す る 免 疫 応 答 の タ ー ゲ ッ ト で あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る 。 gLは 、HSV‑1の10番 目 の 糖 タ ン ′ ヾ ク と し て 同 定 さ れ た 。HSV‑1 gLはcell‑to‑cell fusionに 関 与 し て お り 、 ウ イ ル ス 増 殖 に 必 須 タ ン パ ク で あ る と 考 え ら れ て い る 。
本 研 究 で 利 用 し た 組 換 えFPV発 現 シ ス テ ム は 、 フ ん ウ ル ポ ッ ク ス ウ イ ル ス を ベ ク タ ー と し て 主 に 家 禽 の ウ イ ル ス 性 疾 病 の 解 析 を 目 的 と し て 開 発 さ れ た 。 こ の 発 現 シ ス テ ム を 利 用 し て MDVの 遺 伝 子 産 物 の 解 析 お よ ぴ 感 染 防 御 効 果 を 調 ぺ た 。
本論の要約
本 研 究 論 文 は 、4つ の 研 究 成 果 を ま と め た も の で 以 下 に そ れ ぞ れ の 要 旨 を 述 べ る 。 第1に 、MDVワ ク チ ン 株 で あ るMDV‑2， ．3のglycoproteinB(gB)遺 伝 子(gB‑2，gB− の の ク ロ ー ニ ン グ を 行 い 、 そ の 全 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 そ の 結 果 、gB‐2， ‐3遺 伝 子 の 予 想 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は 、 す で に 同 定 さ れ て い るMDV＿1gB（gB‐J） の そ れ と 比 較 す る とgB． 1／gB―2（83％），gB‐1／gB‐3（82％），gB．2／gB−3（76％）の相同性であり、また3つのgB間では72％の相 同性があった。共 通の特徴としてlOケ 所のシステイン残 基、potennmN‐linked
glycosylanonsiteの80所 が 保 存 さ れ お り 、3つ のgBは 、 お 互 い に 非 常 に 類 似 し た コ ン フ オ メ ー シ ョ ン を と っ て い る と 予 想 さ れ た 。 次 に こ れ らgB遺 伝 子 を そ れ ぞ れ 組 換 え FPVに 挿 入 し 、 発 現 の 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 組 換 えFPVで 発 現 し たgB遺 伝 子 産 物 は 、 と も にMDV感 染 細 胞 で 発 現 し て い るgBと 同 一 分 子 量 で あ っ た 。gB−1とgB‐3は 、 ア ミ ノ 酸 配 列 よ り 予 想 さ れ る 分 子 量 で は ほ ぼ 同 一 で あ る に も か か わ ら ず 、MDV感 染 細 胞 で 発 現 し たgB＿1とgB‐3と は 分 子 量 に 相 違 が あ っ た 。Endoglycosidaseを 用 い た 解 析 の 結 果 よ りgB．1とgBう の 分 子 量 の 差 は 、 糖 鎖 修 飾 の 程 度 に 相 違 が あ る こ と を 明 ら か に し た 。 第2に 、MDV‐1gBのproteolynccleavagesiteの 同 定 お よ ぴ そ の 特 異 性 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。MDV． 1gBの 開 裂 部 位 と そ の 特 異 性 を 解 明 す る た め に 予 想 さ れ る 開 裂 部 位
（Arg‐ku‐Arg‐Arg） に 存 在 す る3つ の ア ル ギ ニ ン 残 基 を そ れ ぞ れ ア ラ ニ ン 残 基 に 置 換 し 、 組 換 えFPVを 使 っ て そ のmutantgB‐1の 発 現 を 解 析 し た 。 そ の 結 果 、3っ の ァ ル ギ ニ ン 残 基 の 置 換 は す べ て 開 裂 を 阻 害 し た 。 ま た 、 開 裂 し な いgB‐1は 、 細 胞 内 輸 送 に お い て 小 胞 体 あ る い は ゴ ル ジ 体 に と ど ま る こ と な く 、wildtypegB．1と 同 様 に 感 染 細 胞 膜 表 面 に 輸 送 さ れ た 。 す な わ ち 、 開 裂 部 位 に 存 在 す る3つ の ア ル ギ ニ ン 残 基 は す ぺ て 開 裂 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る が 、gB‐1の 感 染 細 胞 膜 表 面 へ の 輸 送 に は 開 裂 は 必 須 過程ではないこと を明らかにした。
第3に、 中和モノクローナ ル抗体1AN86のエピトープマ ッビングおよぴ組 換え
FPVの 感 染 防 御 効 果 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。gB‐1に 対 す る 中 和 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 1AN86は 、gB．1と 同 様 にgB‐3も 認 識 す る が 、gB‐2と は 反 応 し な い 。1AN86が 認 識 す る 中 和 エ ピ ト ー プ を 解 析 す る た め に2種 類 のgB．1/gB．2キ メ ラ 遺 伝 子 を 挿 入 し た 組 換 えFPV
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を構 築し た。 キメラタンバクgB21‑ShpIは、N末端半分のgp60がgB‑2由来(gp60‑2)，C末端 半分 のgp49がgB‑l由来(gp49‑1)より 成っ ている。キメラタンパクgB12‑Sphlは、N末端半 分がgp60‑1、C末 端半 分 がgp49‑2よ′ り成 って いる 。1AN86はgB21‑Sphlと反応したが、
gB12‑Sphlと は 反 応 し な か っ た 。 こ の 結 果 よ り1AN86が 認 識 す る中 和エ ピト ープ は、
gp49‑1に存 在し てい るこ とを 明ら かに した 。次 に、gBの 発 現解 析に 用い た一 連の 組換 えFPVにつ いて 、ねWVOで 感染 防御 効果 を比 較し た。 その 結 果、recFPV‑gBlの 感染 防御 率が90%であ るのに対し、recFPV‑gB2(55啣，recFPV‑gB3(33%)の感染防御率は有意に低か った 。一 方、 キメ ラgB21‑SphIの 感染 防御率(90c}6)は、予想通りgB‑lと同程度に高い感 染 防 御 率を 示し 、gB‑2に 導入 したgB‑lの中 和エ ピト ープ が 感染 防御 に重 要な 役割 を果 たし てい るこ とを明らかにした。また開裂しないmutant gB‑1もwild type gB‑lと同程度 に 高 い 感 染 防 御 率 を 示 し 、 開 裂 の 阻 害 は 、gB‑1の 免 疫 原 性 に は影 響を 与え ない こと を明らかにした。
第4に 、MDV‑1の ゲ ノ ムDNAのBamHI‑D断 片 のDNA塩 基 配 列 の 解 析 を 行 い 、HSV‑1 のglycoprotein L(gL)，UL2，UL3遺伝子と相同性のある3つのopen reading frame(ORF)，MDV gL，UL2，UL3 0RFを 同 定 し た 。 同 定 し た3つ の 遺 伝 子 の う ちgL遺 伝子 につ いてMDV‑1 感 染 細 胞で の発 現を 確認 した 。MDV‑1 gLは 分子 量25，OOO‑Daの 糖タ ンパ クで 、PNGase Fで 糖鎖 を除 去す ると 分 子量 は、18，OOO‑Daに 減少 した 。こ の結 果は、アミノ酸配列よ り予想されるシグナルベプチドの開裂部位、20所のN‑linked glycosylation siteを考慮し た 分 子 量 と 一 致 し た 。 さ ら にgL遺 伝 子 を 挿 入 し た 組 換 えFPVを 構 築 し 、 発 現 の 解 析 を行った結果、組換えFPVで発現したgL遺伝子産物(recombinant gL)はnative gLと同じ分 子量 であ った が、 糖鎖 修飾 に明 らか な相 違が 確認 さ れた 。native gLは小胞体からゴル ジ体 、さ らに 細胞 膜表 面に 輸送 され るの に対し、recombinant gLは小胞体にとどまルゴ ル ジ 体 で の 糖 鎖 修 飾 は 受 け て い な い こ と が 明 ら か に な っ た 。 すな わち 、gLの正 常な 糖 鎖 修 飾 、 細 胞 内 輸 送 に はMDV‐1の 他 の タ ン パ ク が 関 与 し て い る と 考 え ら れ る 。
纏 め
ウ ィ ル ス 病 に 果 た し て き た ワ ク チ ン の 役 割 は 大 き く 、多 くの ウィ ルス 感染 症が ワ ク チ ン に よ り 予 防 さ れ て き た。 マッ レク 病も その1つで ある 。マ レッ ク病 は、 養鶏 産 業 に 多 大 な 損 害 を 与 え て お り 、 そ の 防 疫 の た め に は 、 ワク チン が不 可欠 であ る。 本 研 究 で は 、 遺 伝 子 工 学 の 手 法 を 用 い てMDVの 抗 原 タ ン パ ク の 発 現 解 析 等 の 基 礎 研 究 を 行 っ た 。 得 ら れ た 科 学 的 デ ー タ は 今 後 、 社 会 に 寄 与 す る 新 規MDVワ ク チ ン の 開 発 へ と 応 用 さ れ る で あ ろ う 。
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学 位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
マレック病ウイルスの主要抗原の遺伝子同 定と組換え ファウルポックスウィルスを利用した遺 伝子産物の解析
マ レ ッ ク 病 ウ イ ル ス （MDV） は 、 ニ ワ ト りに 感 染 して 、 伝染 性 悪 性リ ン パ腫 の 原 因と な る ウ イ ル ス で あ る 。MDVは へ ル ペ ス ウ イ ル ス 科 に 属 し て お り 、 血 清 型 によ っ て、3種 類 に 分 類 さ れ て いる 。 腫瘍 原 性 が強 く 病因 ウ イ ルス で あるMDV―1と 、病 原 性を 示 さ ず混 合 生 ワ ク チ ン と して 現 在使 用 さ れて い るMDV−2、MDV―3があ る 。ワ ク チ ン株 は 、持 続 感 染 を 起 こ し 、 強 毒 ウ イ ル ス の 重 感 染 を 防 御 で き ず 、 ウ イ ル ス の 排 泄 は 続く が 、腫 瘍 形 成 を 阻 止 す る の で 、 広 く 利 用 さ れ て い る 。 し か し 、 ウ イ ル ス の 感 染 を 防御 し 、ウ イ ル ス の 増 殖 を な く し 、 さ ら に 簡 便 で 、 安 全 な ヮ ク チ ン の 開 発 が 望 ま れ て い る 。 組 組 換 えDNA作 製 に よ る モ サ イ ク 蛋 白 質 の 形 成 や 、DNAの 塩 基 置 換 に よ る 変 異 蛋 白 質 の 作 製 ナ ょど の 遺伝 子 操 作の 技 術は 、 新 しい ワ クチ ン の 開発 に も 有カ な 手段 を 与 え た 。
申 請 者 は 、 鶏 痘 の ワ ク チ ン と し て 使 用 され て い るフ ァ ウル ポ ッ クス ウ イル ス （FDV） に 、MDVの 主 要 抗 原 で あ ル ウ イ ル ス の エ ン ベ ロ ー プ 蛋 白 質 で あ る 糖 蛋 白 質B（gB） の 遺 伝 子 を 挿 入 し て 、 感 染 を 防 御 す る ワ ク チ ン と す る こ と を 試 み た 。 gBは 宿 主 細 胞 へ の ウ イ ル ス の 侵 入 や 、 細 胞 融 合 の 機 能 を 有 し て い る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。
MDV−1のgB遺 伝 子 は す で に 塩 基 琵 列 が 決 定さ れ て おり 、 新た にIdDV←2、MDV―3のgB 遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ し 、 そ の 塩 基 配 列 を 決 め た 。3っ のgBの ア ミ ノ 酸 配 列 に72
％ の 相 同 性 を 認 め 、8か 所 の 糖 鎖 結 合 部 位 は 保 存′ さ れて お り 、高 次 構 造も お 互い に 類 似 し て い る と 予 想 さ れ る 。
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教 教
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gB 蛋 白 質 は 合 成 後 、 2 っの ポ リ ペ プ チ ド鎖 に開 裂す るが、 細胞 表面 では 複合体 を 形成して存在している。開裂部位の，一Arg ―Leu ―Arg 一Arg − の3 っのArg をそれぞれ Ala に変換 した 遺伝 子を作 製し 、その影響を調べた。いずれのArg の変換も開裂を阻害 し た 。 し かし 、開 裂しな いgB も開 裂し た蛋白 質と 同様 に感染 細胞 の表 面に 輸送さ れ る の で 、 輸 送 に は 開 裂 は 必 須 の 過 程 で は な い こ と が 明 ら か に な っ た 。 MDV 一1 に対する中和モノクローン抗体1AN86 の存在が知られているが、そのエピトー プとナょる範囲を決めることができた。抗体1NA86 はMDV ―1 、MDV −3 のgB と反応するが、
MDV −2 のgB を認識 でき ぬい 。い ろいろ なキ メラ 遺伝子 を挿 入したFPV の解析から、中 和 エ ピ ト ー プ は gB 蛋 白 質の C 末 端 部 分 に 存在 する こと が明ら かに なっ た。 従うて 、 この部分を持っキメラ蛋白質を発現しているFPV は、高い感染防御率を示し、ワクチン としての有効性を確認できた。
MDV に は 、gB 以 外に も多 くの糖 蛋白 質が 存在 してい る。 その 中で 糖蛋白 質L はウ イ ル ス増 殖に 必須で 、細 胞融 合に関与している。この糖蛋白質の緒性質にっいての解析 を行った。
ウイ ルス 病に対 する ヮク チンの有効性はいうまでもなく、数多くの例がある。マレ ク ック 病も その1 例 である 。養 鶏業 には 必須の ワク チン にな っている。しかし、ワク チ ンは ウイ ルスに よる 病状 を抑えるだけではなく、感染を防御して、結果として病因 ウ イル スの 撲滅へ と進 むこ とが望ましい。遺伝子操作の技術に期待が集まっている。
し か し 、 組 換 え DNA の 手 段に よ っ て 作 製 した ウイ ルス の安全 性も 十分 に配 慮され な けれぱならない。そのためには、基礎的な研究による豊富な知識の蓄積が重要となる。
申 請者 の研 究は、 安全 で、 より有効なヮクチン開発への道を開くのに重要な貢献をし た と評 価す ること がで きる 。学力試験、語学試験の結果も満足すべきものであり、最 終 試験 にも 合格し た。 よっ て審査員一同は、申請者が博士（理学）の学位を得るのに 十分の資格があると認めた。
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