博 士 （ 医 学 ） 齋 藤 洋
学 位 論 文 題 名
The Role of macrophage IvIigration Inhibitory Factor (IVIIF) in Follicle Growth and Ovulation
（卵胞発育，排卵機構におけるマクロファージ遊走阻止因子の役割）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
緒言
卵巣機能には内分泌系のみならず免疫系の関与が報告され，卵胞発育および排卵機構に おけるサイトカインの役割が明らかになりつっある．マクロファージ遊走阻止因子(MIF) は遅延型アレルギー反応に関与するサイトカインとして発見され，現在炎症，免疫応答の イニシエーターとして機能すると考えられている．一方，MIF ．は細胞の分化増殖能を促 すサイトカインのーつとしても知られ，最近卵巣機能調節への関与が示唆されている．本 研 究 で は， 卵 胞 発 育 お よ び 排 卵 機 構に MIF が関 与す るか否 かに つい て検 討した ． 材料と方法
A) 卵 巣 組織 での MIF の局在 を調 べる 目的 で， 25 日齢 の幼 若雌 性Sprague ― Dawley く S −D) ラットの両側卵巣を摘出し，lAbelled Streptavidin Biotin （LSAB ）法によるMIF 免疫組織染色を施行した．
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B ） 23 日 齢 に 妊 馬 血 清 性 性 腺 刺 激 ホル モ ン Qregnantmareserumgonadotropm ， PMSG ） 151U を皮下投与したS ― D ラット排卵動物モデルを用いて以下の実験を行った．
実験群では，22 日齢より両側子宮付属器摘出前日までウサギ抗ラットMIF 抗体（以下，抗 MIF 抗 体 ） 600 閏 g を 24 時 間 毎 に 3 日 間 腹 腔 内 投 与 した は 群 ） ． 対 照 群 で は同 様に Non ー ImmunoIgG600 ル g を 腹腔 内投 与した （ C 群） ．A 群と C 群に ついて ，以 下の 1 ）
〜 4 冫の比較検討を行った， 1 ）PMSG 投与48 時間後にhCG101U を腹腔内に投与し，その 22
時間後に両側卵管を摘出し，採取した卵数を算出した． 2 ）PMSG 投与47 時間後に摘出し
た両側卵巣の湿重量を計量した．またHE 染色を施行し，卵胞最大径により胞状卵胞（250
ロ m 以 上 500 ロ m 未満， 」弧 ralFOmCle ；AF ），成熟卵胞（500 ロm 以上，ne （）vmatoW
FOmcle ；PF ）の2 種類に卵胞を分類し，全切片中のAF 数およびPF 数を算出した．3 ）PMSG
投与47 時間後にA 群とC 群より摘出した両側卵巣，および同日齢（ 25 日齢）でPMSG 未負
荷・抗体非投与のS ― D ラットより摘出した両側卵巣を採取，凍結保存し，各個体の両側
卵 巣 を 合 わ せ て 各 個 体 毎 の 検 体 と し て ， 卵 巣 組 織 内 の イ ン ヒ ピ ン 濃 度 を
Immunc 岨uorometncassay く IFMA ） 法に より 計測し た． 4 ） PMSG 投与47 時間後に摘出
した卵巣を凍結保存し，各個体の両側卵巣を合わせて各個体毎の検体とし，卵巣組織内の
インヒピン amRNA 発現をノーザンブ口ット法により解析した．それぞれのシグナルは
MHImage 画 像解 析ソフ トに より 定量 化し， イン ヒピ ンa ／Q 虹，DH 比を算出し，比較
検討、した．統計学的検討はUnpaired Student st―testにより行った，なおIFMA法による イ ン ヒ ピン 濃 度 の 比 較 に つ い て は ，OneーFactor ANOVAお よ びTurkey―Kramer法を 用 い て 検定 した ．い ずれ の検 定に つい てもpく0.05を もっ て統 計学 的有意 差と 判定 した ．
結果
A) PMSG未 負 荷 ・ 抗 体 非 投 与 の25日 齢S―Dラ ッ ト （n 2） に 対 し てLSAB法 に よ り MIF免疫 組織 染色 を行 い， 卵巣 の顆 粒膜 細胞 での局在が認められた．また卵巣莢膜細胞に も強い染色が認められた・
B)1）1個 体（ 両側卵巣分）あたりの排卵数は，A群（n＝9）で14.9土9.2個(mean土SD)， C群 くn：11)で34.2土16.3個であ り，C群 と比 較しA群に おい ては 排卵 数が 有意Qく0.01) に 減少 した ． 2)1卵巣あたりの湿重量は，A群くn=10)で20.2土9.5 mg，C群くn=10)で36.4 土5.3 mgで あ り ，C群 と比 較しA群に おい て卵 巣湿 重量 が有意Qく0.01)に減 少し た．1卵 巣 あ た り のAF数 （ 全切 片） は，A群くn=5)で45.0土9.6個，C群くn=5)で38.6土1311個で あり，両群に差はなかった，■方，PF数（全切片）は，A群くn=5)で12.2土5.8個，C群くn=5) で27.8土7.9個で あり ，C群 と比 較しA群 ではPF数が 有意Qく0.01)に減 少し た．3）両側卵 巣組織内のインヒピン濃度はA群くn=9)で1.2土0.7ng/ml，C群くn〓9）で2．8土1.9ng/ml， PMSG非 投 与 群 くn=4)で0.3土0.1 ng/′mlで あ り ，PMSG非 投 与 群 に 対 しC群 で は9．3倍 の ，A群 で は4倍 の イ ン ヒ ピ ン 濃 度 を 示 し た ．A群 とC群 間 ， お よ びC群 とPMSG非 投 与群間に有意Qく0．05）な差を認めた．4）インヒピンQmRNAの発現はA群くn＝6）でO．515 土O．099，C群血 〓5） でO．918土0．064であ り，C群と比較してA群ではインヒピンamRNA の発現が有意￠くO．01）に減少した．
考察
本 研 究 で は ， ま ずPMSG未 負 荷 ， 抗MIF抗 体 非 投 与 で あ る 幼 若 ラ ッ ト に 対 し てMIF 免疫 組織 染色 を行 い， 卵巣顆粒膜細胞での局在を認めた．続いて幼若ラット排卵動物モデ ル に 抗MIF抗 体 を 腹 腔 内 投 与 し ，MIFが 卵 胞 発 育 お よ び排 卵機 構に 関与 する 可能 性を 検 討 し た ， そ の 結 果 ， 抗MIF抗 体 投 与 群 で は 排 卵 数 が 有意 に減 少し た． これ は内 因性MIF が十 分量 あれ ばそ れが 不足 する 場合 より 排卵 数が多 くなることを意味しており，MIFは排 卵 数 調 節 機 能 を 有 す る ことを 示し てい る． また 抗MIF抗体 投与 群で は対 照群 に比 し有 意 差はなかったものの，より未成熟である胞状卵胞数は増加した．一方，より成熟した段階の 成 熟 卵 胞 数 は 対 照 群 に 比し有 意に 減少 した ．卵 巣湿 重量 は抗MIF抗 体投 与に より 有意 に 減少 した ，こ れら は， 抗MIF抗体 投与 によ り多 くの 卵胞が胞状卵胞の段階で発育が阻害さ れた こと を意 味し てお り，MIFが 卵胞 発育 過程 にお いて胞状卵胞から成熟卵胞への発育を 促進することを示している・
本 研 究 に お い て ， 抗MIF抗 体投 与の 卵巣 組織 内で はイン ヒピ ン濃 度お よび イン ヒピ ン mRNA発 現 は 有 意 に 減 少 した． イン ヒピ ンは 重要 な卵 胞発 育調 節因 子で あり ，MIFの卵 巣 顆 粒 膜 細 胞 で の イ ン ヒ ピンの 生成 促進 効果 が示 唆さ れた ．こ れはMIFと 卵胞 発育 の関 連 を さ ら に 補 強 す る 所 見 と 思 わ れ る ． な お 抗MIF抗 体 投与 群 の 中 で ， イ ン ヒ ピ ンamRNA シグ ナル が明 瞭に 減少 しな かっ た例 が6個 体中2個体 にみ られ た． これ が生 じた 原因のー つとしては，アクチピン，insulin like growthfaCtorくIGF）−I，フォリスタチンなどのインヒ ピ ン 以 外 の 卵 胞 発 育 調 節因子 の影 響が 考え られ ，今 後こ れら の因 子とMIFの 関連 につ い ても検討する必要がある．
今回の結果から，MIFは卵巣でのインヒピン産生増加を促進することが強く示唆された．
これは卵巣でのエスト口ゲンの産生増加につながり，LHサージを介した一連の排卵機構 の過程でMIFが関与する可能性が考えられる．一方，抗MIF抗体投与による排卵数およ び成熟卵胞数の減少の割り合いがほぽ同一であることから，MIFは卵胞発育に関与してい る可能性が示唆され今後さらに検討が必要である．
学位論文審査の 要旨
学位論文題名
The Role of macrophage IVIigration Inhibitory Factor (R/IIF) in Follicle Growth and Ovulation
（卵胞発育，排卵機構におけるマクロファージ遊走阻止因子の役割）
卵巣機能には内分泌系のみならず免疫系の関与が報告され，卵胞発育および排卵機構に おけるサイトカインの役割が明らかになりつっある．マクロファージ遊走阻止因子(MIF) は遅延型アレルギー反応に関与し，炎症，免疫応答のイニシエーターとして機能するとと もに，細胞の分化増殖能を促すサイトカインのーっとしても知られている．本研究では卵 胞 発 育 お よ ぴ 排 卵 機 構 に MIF が 関 与 す る か 否 か に つ い て 検 討 し た ・ 卵巣組織でのMIF の局在を調べる目的で，25 日齢の幼若雌性Sprague‑ Dawley (S‑ D) ラヅトの両側卵巣を摘出し，Labelled Streptavidin Biotin (LSAB) 法によるMIF 免疫組 織 染 色を施 行し た． 23 日 齢に妊 馬血 清性 性腺刺 激ホ ルモ ン (pregnant mare serum gon adotropin ，PMSG) ．15 IU を皮下投与したS ．D ラヅト排卵動物モデルを用いて以下 の実験を行った．実験群では，22 日齢より両側子宮付属器摘出前日までウサギ抗ラット MIF 抗 体（以 下， 抗MIF 抗 体） 600 ル g を 24 時間 毎に 3 日 間腹腔内投与した(A 群）．対 照 群 で は 同 様に Non‑Immuno IgG 600 ル g を腹腔 内投 与し た (C 群）． A 群とC 群 につ いて，以下の1 ）〜4 ）の比較検討を行った．1)PMSG 投与 48 時間後にhCG10 IU を腹腔内 に投与し，その22 時間後に両側卵管を摘出し，採取した卵数を算出した．2 いMSG 投与 47 時間後に摘出した両側卵巣の湿重量を計量した．また HE 染色を施行し，卵胞最大径 によ り胞 状卵 胞(250 ル m 以上500 皿m 未満，Antral Follicle ；AF) ，成熟卵胞(500 ル m 以上，Preovulatory Follicle ；PF) の 2 種類に卵胞を分類し，全切片中のAF 数およびPF 数 を 算出し た． 3)PMSG 投 与 47 時 間後 にA 群と C 群 より 摘出 した 両側卵 巣， およ ぴ同 日齢(25 日齢）でPMSG 未負荷・抗体非投与のS ―D ラヅトより摘出した両側卵巣を採取，凍 結保存し，各個体の両側卵巣を合わせて各個体毎の検体として，卵巣組織内のインヒピン 濃 度 をImmunofluorometric assay (IFMA) 法 によ り計 測した ． 4 ） PMSG 投 与 47 時間 後に摘出した卵巣を凍結保存し，各個体の両側卵巣を合わせて各個体毎の検体とし，卵巣 組織 内の イン ヒピン 口mRNA 発現をノーザンブロット法により解析した．それそれの シ グ ナ ル は NIH Image 画 像 解 析 ソ フ ト に より 定 量 化 し ， イ ン ヒ ビ ン a/GAPDH 比を 算出し，比較検討した．統計学的検討はUnpaired Student st‑test により行った．なお IFMA 法 に よ る イ ン ヒ ビ ン 濃 度 の 比 較 に つ い て は ， One‑Factor ANOVA お よ び Turkey‑ Kramer 法を用いて検定した．いずれの検定についてもp く 0.05 をもって統計学
明 雄
典
範 輝
尚
木 橋
上
櫻 石
水
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
的有意差と判定した・
そ の 結 果 ，PMSG未 負荷 ・ 抗体 非 投 与の25日齢S‐Dラ ッ ト（n＝2） に 対し てLSAB法 に よりMIF免 疫組 織 染 色を 行 い， 卵 巣 の顆 粒 膜細 胞 で の局 在 が認 め ら れた ． ま た卵巣莢膜 細胞にも強い染色が認められた．1個体（両側卵巣分）あたりの排卵数は，A群（n＝9）で14.9 士9.2個(m ean土SD），C群 （n=11）で34.2土16.3個 であ り ，C群と 比 較 しA群 に お いて は排卵数が有意（pく0.01)に減少した．2)1卵巣あたりの湿重量は，A群（n〓10）で20.2土9.5 mg，C群 （n＝10） で36.4土5.3 mgであ り ，C群 と比 較 しA群に お い て卵 巣 湿重 量 が 有意
（pく0.01）に 減少した ．1卵巣あ たりのAF数 （全切片）は，A群（n＝5）で45.0土9.6個，C 群（n＝5）で38.6土13．1個であり，両群に差はなかった．一方，PF数（全切片）は，A群（n〓5） で12.2土5.8個 ，C群 （n＝5） で27.8土7.9個 で あ り，C群 と 比 較しA群 で はPF数 が有 意
（pく0.01）に減少した．3）両側卵巣組織内のインヒビン濃度はA群（n＝9）で1．2土0.7n g/ ml， C群 （n＝9）で2．8土1.9ng／ml，PMSG非投与群 （n〓4）で0．3土0.1 ng/mlであ り，PMSG 非 投 与 群 に 対 しC群 で は9.3倍 の ，A群 で は4倍 の イ ン ヒ ピ ン 濃 度 を 示 し た ．A群 とC 群 間 ， お よ ぴC群 とPMSG非 投与 群 間に 有 意 （pく0.05)な 差 を 認め た ．4）イ ン ヒ ピン ぱ mRNAの発 現 はA群 （n〓6） で0.515土0.099，C群 （n＝5）で0.918土0.064で あり ，C群と 比 較 し て A群 で は イ ン ヒ ビ ン ロ mRNAの 発 現 が 有 意 （ pく 0.01） に 減 少 し た ． 本 研 究か ら ，MIFは卵 巣でのイン ヒビン産 生増加を 促進する ことが強 く示唆さ れた．こ れは 卵 巣 での エ ス トロ ゲ ンの 産 生 増加 に っな が り，LHサー ジを介し た一連の 排卵機構の 過 程 でMIFが 関 与 す る可 能 性が 考 え られ る ． 一方 ， 抗MIF抗 体 投与 に よる 排 卵 数お よ び 成熟 卵 胞 数の 減 少 の割り合い がほぼ同 一である ことから ，MIFは卵胞 発育に関 与している 可能性が示唆され今後さらに検討が必要である・
公 開 発 表 に 際 し ， 副 査 の石 橋 教授 か ら ，抗MIF抗体 に よ り内 因 性MIFが 中 和さ れ る 程 度 ， 抗MIF抗 体 投 与 例 の 免 疫 染 色 結 果 ， 抗MIF抗 体 投 与 例 の 血 清MIF値 ，MIF投 与 実 験，卵巣 湿重量と 成熟卵胞 数との関 連，卵巣 組織内の インヒピン 濃度を検 体上清中濃度と 単位蛋白 あたりの 量につい て示した 意味，な どについ て質問があ った．副 査の水上教授か ら は ， 本 研 究 で 示 し た 日 齢以 外 の 日齢 で の 卵巣 のMIF免 疫 染 色の 結 果， 卵 胞 発育 とMIF の関 係 ， 抗MIF抗 体 投与 に よル イ ン ヒピ ン ，成 熟 卵 胞数 ， 排卵 数 が 減少 し た 機序，など について質問があった．主査の櫻木教授からは，MIF発現につし、ヽてのin situ hybridization 実験 に つ いて ， イ ンヒ ピ ンが 産 生 され る 顆粒 膜 細 胞に お けるMIFレ セプ タ ー の存在，な どについ て質問が あった． これらの 質問に対 して，申 請者は自身 のこれま での研究成績や 文献的情報をもとに概ね妥当な回答をなしえた．
審査員一 同は，こ れらの成 果を高く 評価し， 大学院課 程における 研鑽や取 得単位なども 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ）の 学 位 を受 け る のに 十 分な 資 格 を有 す るも の と 判定 し た．
